[发明专利]一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其制备方法与应用

说明书

技术领域  

本发明涉及人重组基因肺上皮细胞，特别涉及一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其应用。

背景技术

选择一个理想的模型是做好科研工作的必备条件，细胞无疑是科研中比较理想、也很常用的研究模型。一方面单一的细胞可减少实验间的误差，保证研究结果的可控性和可重复性；另一方面细胞试验周期短、成本低、实验条件要求不高。因此备受广大科研工作者的青睐。随着研究的不断深入，人类已进入后基因组研究时代，其核心内容就是研究基因的功能。由于大部分细胞系中特定蛋白低表达或不表达，因此亟需构建高表达目的蛋白的细胞模型。

目前一般采用腺病毒的方法构建瞬时表达目的蛋白的细胞，但往往效果不尽人意。主要是由于瞬时表达的细胞，目的蛋白的表达不稳定，且不同实验间的差异有时非常大。此外，用腺病毒构建稳定表达细胞的效率低、成果率小，往往费时费力。因此，亟需使用稳定可靠的载体系统通过稳定转染和单克隆筛选，以获得稳定高表达目的蛋白的特定细胞。

鉴于上述因素，本发明利用新型慢病毒系统构建稳定表达人细胞色素P450 2A13（CYP2A13）的肺支气管上皮细胞（BEAS-2B），简称为BEAS-2B/CYP2A13细胞，以期为研究药物代谢活化作用以及呼吸系统肿瘤及分子机制提供理想的细胞模型。

发明内容

发明目的

本发明采用新型慢病毒系统来构建细胞模型，具体来说提供一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其应用。

一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO： C2010127；保藏时间为2010年12月7日。保藏地址为中国 武汉 武汉大学。

一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的制备方法，其特征在于

具体制备步骤如下：

A. pLJM1-GFP-CYP2A13质粒构建及验证

通过内切酶双酶切以及酶连的方法构建含有目的CYP基因的慢病毒质粒pLJM1-GFP-CYPs，即对本实验室现有的pFastBac^TM 1-CYP2A13质粒与慢病毒专用空载质粒pLJM1-GFP同时进行酶切，回收酶切产物后分别进行酶连，然后转化DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆提取重组质粒，对重组质粒使用各基因特异引物进行PCR验证；

B. 慢病毒载体包装以及感染BEAS-2B细胞

传293T细胞至60mm培养皿中，细胞密度达到80-90％融合度时进行转染；制备脂质体转染复合物：DMEM 无血清，无双抗，转染每皿的复合物含6ug pLJM1-GFP-CYPs质粒、3ug pVSVG、4.5ug delta 8.91以及15ul Sofast转染试剂，将复合物加至培养皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混匀， 将此细胞放至37℃ CO₂培养箱培养，6-8h后更换新鲜完全培养基； 转染24h后，通过观察293T细胞绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率；收集病毒上清，此即为含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用该完整慢病毒上清过滤后感染BEAS-2B细胞，同时加入10ug/mL的polybrene和HEPES；感染24h后重复感染一次。构建稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞BEAS-2B/CYP2A13；

C. BEAS-2B/CYP2A13细胞的验证

分别收取慢病毒感染成功后一周和两周的各BEAS-2B/CYP2A13细胞总蛋白，使用CYP2A13的特异性抗体，采用免疫印迹方法验证BEAS-2B/CYP2A13细胞中的蛋白表达；

D. 流式细胞仪分选BEAS-2B/CYP2A13细胞株

为保证转染细胞的纯度，使用流式细胞仪对BEAS-2B/CYP2A13细胞株进行了GFP阳性细胞分选；未转染的正常细胞无荧光，转染细胞的荧光强度明显增强，通过分选，将荧光强度较强的细胞分选出来，以保证细胞为100%转染细胞；

E. BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的挑选及验证

将GFP阳性的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以每孔1个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板，结果7-10天后，对形成单克隆的细胞进行放大培养，直到细胞满足实验和保存要求为止；对筛选出的单克隆细胞进行验证，选取CYP2A13蛋白表达高且稳定的细胞作为后续实验和保存之用。