[发明专利]一种α-淀粉酶固定化的方法无效
申请号: | 201010593160.3 | 申请日: | 2010-12-17 |
公开(公告)号: | CN102154254A | 公开(公告)日: | 2011-08-17 |
发明(设计)人: | 乔敏;李小冬;余泽芬;张克勤;周薇;贾东晨 | 申请(专利权)人: | 云南大学 |
主分类号: | C12N11/00 | 分类号: | C12N11/00 |
代理公司: | 昆明今威专利代理有限公司 53115 | 代理人: | 杨宏珍 |
地址: | 650091*** | 国省代码: | 云南;53 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 淀粉酶 固定 方法 | ||
技术领域:
本发明涉及一种α-淀粉酶固定化的方法,属生物工程技术领域。
背景技术:
交联酶聚集体CLEAs是2000年荷兰Delfe大学的Sheldon小组提出的,主要利用诱导剂将酶形成物理凝集,然而其活性位点并不遭到破坏,蛋白质形成了超分子结构,底物通过聚集体的中间空隙与酶的活性位点作用,从而酶的活性位点避免与外界的微环境的直接作用。目前国内对CLEAs的研究较少,而国外研究较多。
交联酶聚集体固定化方法具有以下特点:a)对酶的纯度要求不高、不需要结晶等复杂步骤,理论上能被沉淀下来的酶或蛋白都可用该法制成交联酶(蛋白)聚集体,因而操作更加简便,应用范围更广;b)获得的固定化酶稳定性好、活性高,与游离酶相比,某些脂酶的交联酶聚集体活性甚至可提高10倍以上;c)成本低廉,设备简单,一般实验室都可以实行,易于推广;d)无需其他载体,因而单位体积活性大、空间效率高。因此,CLEAs技术是一种很有发掘潜力的酶固定化方法。
α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂,大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等。它占了整个酶制剂市场份额的25%左右,使用多以游离酶为主。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。
α-淀粉酶分布十分广泛,遍及微生物至高等植物。其国际酶学分类编号为EC.3.2.1.1,作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1,4糖苷键,生成糊精和还原糖,由于产物的末端残基碳原子构型为α构型,故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1,4糖苷键起液化作用的一类酶。
α-淀粉酶的固定化目前应用较多的方法有壳聚糖包埋、磁性聚乙烯醇缩丁醛微球包埋吸附、氧化锆和氧化铝吸附、超多孔纤维素交联、及中孔性的硅石吸附,采用交联酶聚集体固定α-淀粉酶使得固定后的酶活性达到游离酶活性的50%以上还未见报道。然而这些吸附交联或者是包埋固定化的酶的量都很小,酶的活性损失都比较严重,另外包埋之后影响底物与酶活性位点的接触,也同时增大了位阻,酶的半衰期及存活时间都比较短,导致很难在工业化生产中使用。
发明内容:
本发明的目的在于克服以往交联固定化方法成本高、制备过程复杂的缺点,提供一种α-淀粉酶固定化的方法。
本发明的α-淀粉酶固定化的方法,是交联酶聚集体固定化方法的改进,其步骤如下:
a.将α-淀粉酶的相酶加入相对酶溶液体积1/3的100mM、PH7.0的磷酸缓冲液溶解300rpm常温搅拌15min,制得粗的α-淀粉酶溶液;或将发酵液10000rpm离心15分钟,除去菌体,取上清液;
b.向得到的粗酶液中加入固体硫酸铵,使得溶液中固体硫酸铵的质量百分比为80%,300rpm常温搅拌30min,边加入边搅拌,每10分钟取上清液离心测定蛋白质含量,使95%以上的酶沉淀后,10000rpm4℃离心15min,去上清液,添加与离心前等体积的pH 7.0、100mM的磷酸缓冲液溶解纯化后的酶;
c.取b中1.6ml酶液,加入1/4体积的100mM、PH 7.0的磷酸缓冲液,然后缓慢加入的固体硫酸铵,使得溶液中的固体硫酸铵的质量百分比为40-80%,300rpm室温或冰水浴搅拌30min,务必要保证的硫酸铵固体添加均匀,生成α-淀粉酶聚集体;
d.向生成的α-淀粉酶聚集体中加入体积百分比1-8%的淀粉溶液作为底物保护剂,使得淀粉在反应溶液中最终体积百分比达到0.5-4%,持续搅拌10min,再加入的固体硫酸铵,使得反应液中的固体硫酸铵的质量百分比为40-80%,持续搅拌20min,然后加入体积百分比为50%的戊二醛溶液,使溶液中戊二醛的最终体积百分比为0.1%-0.5%,持续搅拌1.5-2.5小时,生成交联α-淀粉酶聚集体;以上淀粉的加入并没有先后顺序;
e.向交联α-淀粉酶聚集体中加入100mM的最终体积百分比为3%-6%的硼氢化钠溶液,持续搅拌15min,置于-2到8℃冰箱中静置3-24小时,进一步形成交联α-淀粉酶聚集体;
f.将得到的交联α-淀粉酶聚集体,12000rpm4℃离心洗涤4次除盐和交联剂,每次加入4ml100mM、PH 7.0的磷酸缓冲液洗涤,直到上清液中蛋白质含量小于5%为止,加入1.6ml的100mM、PH7.0的磷酸缓冲液溶解已经制备好的交联α-淀粉酶聚集体,或洗涤之后进行30℃真空干燥30min,然后用1.6ml的100mM、PH 7.0的磷酸缓冲液溶解,300rpm搅拌20min。测定固定化后的α-淀粉酶的活性,与原酶液活力对比,计算酶的酶活力回收率。备用。
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