[发明专利]一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，涉及一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，具体来说，涉及一种将同位素示踪、离心和超滤技术相结合用于测定多肽药物与血浆蛋白的结合的方法。

背景技术

药物进入血液后，一部分呈非结合的游离状态存在，一部分与血浆蛋白形成结合型药物，如弱酸性药物与白蛋白结合，弱碱性药物与α1-酸性糖蛋白结合等。药物与血浆蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程，并降低药物在靶部位的作用强度。大多数药物与血浆蛋白的结合处于动态平衡，存在饱和及竞争性抑制现象，其与药物之间的相互作用及作用机制等密切相关。药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总量的百分率，是药代动力学的重要参数之一。研究药物血浆蛋白结合率对新药评价及指导临床安全合理用药，尤其是对毒性药物的临床合理应用具有重要意义。

目前，药物血浆蛋白结合率的研究方法主要包括平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、微透析法、高效亲和色谱法等。其中，平衡透析法是一种传统的方法，但该法所需平衡时间较长，血浆和缓冲液的pH值以及离子强度要严格控制，药物血浆蛋白结合率会受到稀释作用、Gibbs-Donnan效应以及体积迁移效应的影响，并且存在非特异性透析设备表面的药物吸附效应。而超滤法设备简单、操作方便、不受稀释效应和体积迁移的影响，尤其能实现血浆中游离药物和结合药物的快速分离，已被广泛应用于高通量的生物样品测定中。

现今，许多化学药物和中药的血浆蛋白结合率的测定方法已较完善，常将上述方法与高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MS)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)等分析技术结合。多肽类生物技术药物因生理活性强、疗效高而日益受到重视。但此类药物在结构上不同于传统药物，生物活性强，给药剂量小，在体内定量分析时存在体内药物浓度低，内源性物质干扰强，样品前处理困难，内标不易寻找等难点。常见的测定方法主要包括同位素示踪法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法、生物检定法、色谱法和质谱法等。其中，同位素示踪法是生物技术药物代谢动力学研究的主要手段之一，具有灵敏度高，简便直观，检测迅速等特点，特别是适用于组织分布及排泄研究中。通常所使用的同位素包括¹²⁵I、^99mTc、³H、¹⁴C、³⁵S等，而¹²⁵I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单而最为常用。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，该方法将同位素示踪、离心和超滤技术集成于一体，成功地运用到多肽生物药物蛋白结合率的测定方法中。实验表明，这种以同位素示踪法为主要定量手段的多肽类等生物技术药物血浆蛋白结合率测定方法能够成功地应用于重组人胸腺肽(rh-Tα1)及重组人甲状旁腺素类似物PTHa(1-34)等多种多肽类药物的血浆蛋白结合率测定和研究。

本发明提供的用于测定多肽药物与血浆蛋白的结合的方法包括以下步骤：

(1)采用放射性同位素标记多肽药物的一部分；

(2)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成一系列已知浓度的多肽药物血浆溶液，分别定量检测各已知浓度的多肽药物血浆溶液的放射性，并分别对应于多肽药物的浓度绘制标准曲线；

(3)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成已知浓度的待测多肽药物血浆溶液，将其离心超滤，定量检测滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性，其中待测的多肽药物血浆溶液的浓度为多肽药物在提供血浆的受试动物的血药浓度峰值的±10％的范围。例如，所述待测的多肽药物血浆溶液浓度的设置可根据多肽药物在动物药代动力学研究中的低、中和高三个剂量组给药后的血药浓度峰值，设计三个浓度(如，基本与峰浓度一致或变化幅度＜10％)；

(4)根据标准曲线分别由滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性得出两者的多肽药物浓度，滤过溶液的多肽药物浓度为游离型多肽药物浓度，未滤过溶液的多肽药物浓度为与血浆蛋白结合的多肽药物浓度。

在上述方法中，优选地，多肽药物为人胸腺肽和人甲状旁腺素。

在上述方法中，步骤(1)中的放射性等同位素可以选自¹²⁵I、^99mTc、³H、¹⁴C或³⁵S，优选为¹²⁵I。优选的标记方法为氯胺T法或Iodogen法。优选地，加入0.05g/ml海藻糖水溶液作为保护剂。