[发明专利]PCR法检测抗抑霉唑柑橘绿霉菌菌系的引物序列及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种PCR法检测抗抑霉唑柑橘绿霉菌菌系的引物序列及方法。

背景技术

我国是世界柑橘生产的第一大国，目前我国柑橘的栽培面积(2700万亩)和产量(2500万吨)，均居世界第一。由柑橘绿霉病菌(Penicilliumdigitatum)造成的柑橘绿霉病是柑橘采后贮藏和销售期间的最主要病害，如果不使用药剂处理，一般年份该病害可导致20-30％的采后柑橘腐烂。

1990年开始，我国广泛应用杀菌剂抑霉唑(imazalil)处理采后柑橘以防治贮藏期的绿霉病发生。但由于长期使用，抗抑霉唑的柑橘绿霉病菌系已在各柑橘产区陆续发现，在抗性菌株存在的贮藏库，常规剂量的抑霉唑对绿霉病的控制效果很差，甚至完全失效。因此，建立抗性菌株的快速检测技术对指导果农科学用药，保证防治效果极有必要。

已有的研究发现，柑橘绿霉病菌对抑霉唑的抗性存在2种分子机制。(1)14α-脱甲基酶基因CYP51启动子区的一个126-bp转录增强子简单串联重复了5次，比敏感菌株多了4次(Hamamoto H，Hasegawa K，NakauneR，et al.Tandem repeat of a transcriptional enhancer upstream of the stetol14α-demethylase gene(CYP51)in Penicillium digitatum[J].Applied andEnvironmental Microbiology，2000，66(8)：3421-3426；Li H Y，Xie Q Y，SongA H.Sequence comparison of CYP51 genes between imazalil-sensitive andimazalil-resistant strains of Penicillium digitatum(in Chinese)[J].Mycosystema(菌物系统)，2003，22(1)：153-256.)，我们称之为抑霉唑抗性I型；(2)CYP51启动子区的126-bp转录增强子中插入了一段199-bp核苷酸序列(Ghosoph J M，Schmidt L S，Margosan D A，et al.Imazalil resistancelinked to a unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region ofPenicillium digitatum[J].Postharvest Biology and Technology，2007，44：9-18)，我们称之为抑霉唑抗性II型。这些额外插入导致抑霉唑靶标(CYP51)基因的表达上升，从而使病菌抗药性出现。基于以上抗性分子机制，国际上和国内(本实验室)已经建立快速的分子检测体系(HamamotoH，Hasegawa  K，Nakaune  R，et al.PCR-based detection of steroldemethylation inhibitor-resistant strains of Penicillium digitatum[J].PestManagement Science，2001，57：839-843.；Chen G J，Zhang Z F，Jiang L Y，etal.Real-time PCR assay for detection of the frequency of i mazalil-resistanceof Penicillium digitatum(in Chinese)[J].ACTA PHYTOPATHOLOGICASINICA(植物病理学报)，2008，38(6)：561-569)。