[发明专利]一种病毒样颗粒手足口病疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒样颗粒手足口病疫苗及其制备方法。

背景技术

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是亚太地区近年出现的一种儿童传染病，又名发疹性水泡性口腔炎，以手、脚和口腔粘膜疤疹或破溃成溃疡为主要临床特征，其病原体是几种肠道病毒。

1957年，本病最先被报告流行在1957年的新西兰，第二年分离出柯萨奇病毒，1959年提出HFMD的命名。此后有多个国家和地区都报告HFMD的发生和流行，如美国、英国、澳大利亚、日本、新加坡、匈牙利、保加利亚等。

在中国大陆，1981年上海首先报道手足口病的发生，其后，个别城市也曾发现并报告该病的局部流行；1983年和1986年天津出现了两次大规模的爆发流行，主要的病原体为柯萨奇A组16型病毒。2007年以来，手足口病在中国大陆大爆发，引起200多万儿童感染，500多人死亡。自2009年起至今，新一轮爆发一直在中国大陆蔓延。

手足口病的病原体包括数种肠道病毒：属于小RNA病毒科，肠道病毒属成员，常见的病毒型别是柯萨奇A组16型(Coxsakie A₁₆，CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)。此外，柯萨奇A组2、4、5、7、9、10型以及B组1-5型等型别病毒所致的HFMD也时有报道。这些病毒可交替或同时出现，所以在一次流行中可发现有两种或两种以上病原同时存在的现象。

感染EV71和Cox.A16所引起的临床症状难于区别。感染EV71常常并发严重的神经炎症，包括病毒性脑膜炎，脑炎，以及类似小儿麻痹的瘫痪，引起的肺水肿、肺出血经常导致婴幼儿的快速死亡。Cox A16是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它严重疾病的重要病原。手足口病从感染到出现症状通常为3-6天。病人常在口中出现疮，手掌、脚底出现皮肤红疹。有些病例，主要是小于3岁的婴幼儿，会出现严重的并发症，短期发烧后突然恶化，并快速死亡。

在流行中观察到，COXA16和EV71引起的流行不同，CoxA16引起的流行可发生在四季，流行季节长，春末夏初出现高峰，而EV71流行时则集中在夏季，CoxA16多在婴幼儿中流行，而EV71还会流行于较大儿童或成人，且所致临床经过较重，常有中枢神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎等，而CoxA16所致症状典型，且并发症少，预后良好。

EV71病毒颗粒呈球形，无包膜和突起，衣壳为正20面体对称，直径大约在24nm～30nm，由60个相同的亚单位构成，每个亚单位均包含VP1～VP4四种结构蛋白拼装成五聚体样结构，其中VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VP1～VP3暴露在病毒颗粒表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上。

目前尚无有效的疫苗或药物可防治手足口病。

病毒样颗粒(VLP)是由病毒衣壳蛋白组成的不含病毒核酸的病毒粒子空壳。由于VLP表面的病毒抗原和多肽表位与真正的病毒几乎没有区别，因此能引起强的免疫反应，且不具有潜在的副作用，是目前认为最有潜力的疫苗研究方向。乙肝病毒VLP疫苗(Recombivax HB，Merck)和乳头瘤病毒VLP疫苗(Gardisil，Merck)已经上市。

YPD液体培养基为常规培养基。其具体组成可为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，其余为水；各百分含量均为质量百分含量。若制固体培养基，加入2％琼脂粉。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备病毒样颗粒的重组酵母菌。

本发明所提供的用于制备病毒样颗粒的重组酵母菌，按照包括如下步骤的方法制备得到：将构建病毒样颗粒所需的蛋白的编码基因导入出发酵母菌，得到重组酵母菌。

上述重组酵母菌中，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述出发酵母菌中的；所述重组表达载体按照如下方法得到：将所述编码基因插入酵母表达载体的多克隆位点，得到所述重组表达载体。

上述任一所述重组酵母菌中，所述酵母表达载体为pGAPZa-A。

上述任一所述重组酵母菌中，所述出发酵母菌为SMD1168。

上述任一所述重组酵母菌中，所述病毒样颗粒为引起手足口病的病毒的病毒样颗粒。

上述任一所述重组酵母菌中，所述引起手足口病的病毒为EV71；所述构建EV71病毒的病毒样颗粒所需的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：3所示；所述重组表达载体为如下1)和2)所示：