[发明专利]一种小分子代谢物图谱及其制作方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及医学诊断学技术领域，是一种鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿及正常人的血液小分子代谢物图谱及其制作方法。

背景技术

代谢组学作为后基因组时代系统生物学领域中重要的技术手段，近年来得到了长足的发展。代谢组学的着眼点在于病理刺激或者基因修饰后，细胞、组织、器官在内所有代谢物量的动态变化，从整体角度通过代谢物的变化对于疾病的发生发展进行系统描述。体液内的所有的代谢物可以作为生命系统状态的指针，不仅能够反映各种生理调节的结果，也可以发展为辅助临床诊断的有力工具。目前，在包括癌症、糖尿病、心血管疾病等疾病的研究中发现了相应的诊断代谢标志物。而应用一组血液小分子代谢物构成的代谢谱对疾病进行诊断的方法的发展在国际上正处于一个快速的发展阶段，可能在未来对疾病的临床诊断中产生重大的影响。

甲状腺癌是头颈部的第一高发肿瘤，近年来甲状腺癌的发病率显著增高，已经成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一。以美国为例，近30年甲状腺癌的发病率就增加了2-3倍，甲状腺癌已占女性恶性肿瘤的第七位。目前美国每年甲状腺癌的新发病例已高达3-4万人。

甲状腺肿瘤可以分为良性肿瘤和恶性肿瘤两类。绝大部分恶性甲状腺癌的发生来自滤泡上皮，少数可来自滤泡旁细胞，极少数来自甲状腺的间质。临床上常把甲状腺癌分为：乳头状癌、滤泡状癌、末分化癌和髓样癌四种。其中乳头状癌是最常见的种类，约占75％。

临床上甲状腺肿瘤往往仅表现为甲状腺结节，因此常把甲状腺肿瘤与甲状腺结节相混。实际上结节仅是形态的描述，它包括肿瘤、囊肿、正常组织构成的团块以及其他疾病所引起的甲状腺肿块。临床上难以确定甲状腺结节的性质，即使病理活检，有时甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤与恶性肿瘤也不易明确辨认。目前尚缺少标志物可用于甲状腺结节的良恶性的判断，也未见采用血液小分子代谢物图谱鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺结节或正常人的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于根据代谢组学这一系统生物医学领域新的理论及方法体系，建立一种由血液小分子代谢物组成的图谱及其制作方法。2个血液代谢标志物，即1-磷酸鞘氨醇(Sphinganine)和羟基丁酸(Hydroxybutyric acid)，它们的分子量分别为：453.2855和569.3481，质谱上检测到的对应离子分别是454.2928和570.3547。

临床实验表明，该图谱甲状腺癌判定的准确率为82％，非癌(良性甲状腺肿和正常人)判定的准确率为75.3％。。本发明方法具有高灵敏度、高通量的优点，弥补了现在临床上缺少非侵入性的甲状腺结节的良恶性诊断方法的不足，适用于甲状腺癌的筛查和辅助诊断。

本发明图谱的制作方法如下。

本发明是从正常人、单纯性甲状腺肿和乳头状甲状腺癌的3组样本的血清中以代谢组学的方法筛选出可用于甲状腺结节良恶性诊断的代谢标志物组，构成肝癌诊断代谢物谱。其中，血液代谢物获取方法如下：

1)获取研究对象血液样本。

血样为清晨餐前空腹血液，采集后于4℃静置半小时、9000g条件下离心15分钟取上清后立即储存于-80℃的冰箱中备用。

2)血样预处理

将样品室温解冻。取50μL血样加入200μL乙腈，剧烈震荡后于4℃静置10分钟，然后在4℃下以15000g离心10分钟，取上清4μL进样。

3)样本分析

色谱分析采用的是安捷伦1200系列快速分辨液相色谱，液相色谱柱采用的是C18柱，质谱分析采用的是安捷伦6510四极杆-飞行时间质谱。

4)血液小分子代谢物轮廓获取

利用软件从原始数据中提取化合物信息，计算准确分子量并做色谱峰匹配。匹配后的数据经过归一化以减少系统误差。

用于甲状腺癌良恶性诊断的小分子代谢物谱的筛选过程如下：

通过病理诊断明确的甲状腺良性结节和恶性乳头状甲状腺癌以及正常人的各组，以统计学方法，如多因素方差分析、Z值等寻找特异性代谢物，筛选乳头状甲状腺癌同良性甲状腺结节以及正常组人具有显著差异的代谢物。对于差异代谢物进行进一步的过滤，以采取尽可能少的代谢物，达到更好效果为前提，最终确认2个代谢物构成肝癌诊断代谢物谱。该组代谢物对乳头状甲状腺癌的判定的准确率为82％，良性甲状腺结节的准确率为75.3％。

本方法具有良好的扩展性，可以通过加入新的代谢标志物提高相应的判断能力。本方法同时适用于其它疾病早期诊断标志物的开发，同时，发现的标志物组具有开发成为诊断试剂盒的前景。

附图说明