[发明专利]基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离方法。

背景技术

香蕉是仅次于水稻、小麦和玉米的全世界第四大粮食作物。据联合国粮农组织(FAO)统计，近10年来，世界香蕉种植面积总体上呈增长的趋势， 2007年种植面积为6615.75万亩，产量达到8126.34万吨，创历史新高。2007年中国香蕉收获面积为458.25万亩，列世界第5位；总产量732.50万吨，排世界第2位。但是该产业的发展正遭受到枯萎病的毁灭性威胁，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)。病原菌从香蕉幼根或根部损伤部位侵入球茎、假茎，引起维管束褐变和系统侵染, 造成植株整株枯死。病原菌属于土传真菌，在土壤中可以存活长达30年。

香蕉枯萎病已经造成相当大的危害。上个世纪，病原菌1号（Foc1）生理小种破环了中美洲数千个香蕉园，现在世界范围内对香蕉产业的发展造成毁灭性的威胁为4号（Foc4）生理小种，已经导致我国台湾地区香蕉种植面积锐减为原来的十分之一。大陆地区种植的香（大）蕉中，90%以上为易感Foc4的香牙蕉品种，2003年发病面积已经达到2万公顷，并有迅速蔓延的趋势。

目前还没有找到一种有效的防治香蕉枯萎病的化学药剂, 香蕉只能在不含病菌的土壤上生长。抗病育种是当前解决香蕉枯萎病比较有希望的途径。现在生产上已经筛选到一些抗病突变体，如果能够克隆这些突变基因，再进一步转化到一些优良品种中，就可以控制该病害。 

对于这样的自然突变，目的基因的染色体位置、序列以及产物的序列和功能等信息都是未知的，克隆该类基因的一个方法是图位克隆法，即先构建杂交群体，进行染色体定位，最后通过染色体步行法分离该基因。但是图位克隆法较为适合那些生育周期比较短、有饱和遗传连锁图谱、染色体比较小、基因组中重复序列不多、已经构建了成熟的遗传转化系统的物种。香蕉显然不具备这些条件，虽然现已构建了一些群体，但其遗传图谱的饱和度还比较低，分子标记间的平均距离在10cM以上，较长的童期影响了F2代群体的构建，香蕉基因组大小为600M以上，重复序列多影响了染色体步行的进行。所以利用图位克隆法分离该突变基因还存在很大的困难。另外一个方法是表型克隆法，仅仅根据有关基因的突变产生的表型变化就直接分离该基因的克隆策略，而不必事先探知其生化功能或图谱定位，甚至也不需假设基因的数目或其相互作用的方式，即将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因。但是现有的表型克隆方法，如基因组扣除法，由于不能解决酶切片段间的特异性杂交问题，从而限制了它们的进一步应用。

发明内容

本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种利用MutS蛋白在基因组范围内检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种突变基因的识别和分离方法，包括以下步骤：用生物素标记野生型DNA片段，将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合，进行变性和复性；此时含有突变位点的DNA片段因为没有相同迁移率的生物素标记野生型DNA片段与之杂交而无法形成异源双链DNA分子，而裸露在外；而不含有突变位点DNA片段与相应的生物素标记野生型DNA片段杂交，形成异源双链DNA分子；再采用链霉亲和素磁珠吸附，将带有生物素标记的分子吸附回收，实现不带有生物素的含有突变位点的DNA片段的分离。

在将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合时，需要采用过量的野生型DNA片段与少量的待检测的DNA片段混合，两者摩尔比例为20-50:1。

被分离出来的突变位点的DNA片段，可以根据两端连接的接头序列，而被扩增出来，可以根据序列分析其突变的机理。

上述的野生型DNA片段与待检测的DNA片段，是将野生型和突变体基因组DNA分别提取并采用限制性内切酶进行消化，并进一步连接接头获得的。该限制性内切酶采用可以利用识别4或6碱基的，并且能够产生粘性末端的限制性内切酶，以便连接接头。

将野生型和突变体基因组酶切后获得的DNA片段分别连接接头，所采用的接头均为SEQ ID NO:1（5‘-CATGCTTGTAGACTCACA-3’）和SEQ ID NO:2（3’-ACGAACATCTGAGTGTGC-5’），不同的是其中野生型DNA片段连接的是经生物素标记的接头，而突变体DNA片段连接的是经生物素标记的接头。