[发明专利]尾叶桉遗传转化与再生的方法

权利要求书

1.一种尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：采用尾叶桉无性系种子萌发实生苗的下胚轴为外植体进行遗传转化与再生；愈伤组织诱导后与携带外源基因的农杆菌共培养，经不定芽诱导培养、芽增殖培养、不定芽伸长培养、选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。

2.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：选取成熟的尾叶桉种子，经50～55℃温水浸泡后自然冷却，经70％乙醇灭菌1分钟，无菌水冲洗2次，加入体积比为15％NaClO溶液，相对氯为3.75％，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次，播种到不加激素的1/2MS培养基上，25±2℃暗培养7天后，在光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养5～7天，得到实生苗；

所述1/2MS培养基是大量元素为MS的一半，其它不变；添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述尾叶桉遗传转化利用下胚轴为外植体，下胚轴是指实生无菌苗苗龄为12～14天的下胚轴。

4.根据权利要求1所述的尾叶桉遗传转化与再生方法，其特征在于：所述农杆菌介导的转化，农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.6，MS液体培养基重悬菌落，再将重悬的菌液用MS液体培养基稀释20倍，浸染液pH为5.6。

5.根据权利要求1所述的尾叶桉遗传转化与再生方法，其特征在于：所述共培养是指尾叶桉无菌苗下胚轴经农杆菌介导转化后，转入共培养基暗培养6天，培养温度为25±2℃；

所述共培养基为MS+LC 2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

6.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述不定芽诱导培养是指经共培养基上培养的下胚轴转入选择性不定芽诱导培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周，在两端切口外周膨大成哑呤状的愈伤处长出再生芽点；

所述选择性不定芽诱导培养基为SDM+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

7.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述芽增殖培养是指经选择性不定芽诱导培养基培养的下胚轴转入芽增殖培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

所述芽增殖培养基为SDM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

8.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述不定芽伸长培养是指经芽增殖培养基培养的下胚轴转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；

所述不定芽伸长培养基为1/2MS+NAA 0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

9.根据权利要求8所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：再生芽在不定芽伸长培养基上再培养，芽可以继续生长伸长，待芽伸长至约3～4cm并有3～4个节时，伸长芽最适宜生根。

10.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述选择性生根培养是指不定芽伸长后转入选择性生根培养基上培养，以促其生根；

所述选择性生根培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+Kan 75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

11.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述移栽是指将生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，用灭菌的黄心土与腐殖质土，比例为2∶1，进行移栽，得到完整的尾叶桉植株。