[发明专利]μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的制备方法，尤其涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法，属于μ-芋螺毒素-KIIIA的制备领域。

背景技术

近年来，随着分子生物学与电生理，尤其是膜片钳技术的发展，人们认识到Na⁺通道的结构和功能变化是慢性疼痛的病理生理机制，应用特异性的Na⁺通道亚型阻止药治疗慢性顽固性疼痛可取得良好的效果。

μ-芋螺毒素是高度特异的Na⁺通道阻滞剂，可以区分Na⁺通道的不同亚型(Shon K，Olivera BM，Watkins M，et al.μ-Conotoxin PIIIA，a new peptide for discriminating among tetrodotoxin-sensitive Na channel subtypes.)，因其序列短，活性高，选择性强，已证实具有显著的镇痛效果(Fusetani N.Drugs from the sea.Karger：Basel Freiburg Paris London New York.2000；1-5.)，对于发展钠通道探针及镇痛药物具有重要意义。

高选择性的TTX-R钠通道抑制剂对神经性疼痛或炎症痛非常有效，且副作用低。作用于TTX-R VSSCs的芋螺毒素μ-SmIIIA、SIIIA和KIIIA等，已发现具有显著的镇痛作用(Haefner B.Drugs from the deep：marine natural products as drug candidates.Drug Discov Today.2003；8(12)：536-544.)，目前芋螺毒素的获得主要是直接提取或人工化学合成(权娅茹，罗素兰，林秋金，长孙东亭，张本.芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究.中国海洋药物杂志.2005；24(2)：1-5.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用基因工程获得μ-芋螺毒素--KIIIA的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制备方法，包括：将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。

其中，所述的μ-芋螺毒素-KIIIA基因是通过合成单链DNA序列，形成双链目的DNA序列而获得的；

所述的带有Trx-tag的原核表达载体优选为pET-32a(+)；硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一组小分子蛋白质，分子量约为12Kd，广泛存在于真核生物和原核生物中，它们都包含二硫键活性位点序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，是巯基-二硫键氧化还原酶。其主要作用是可以增加重组蛋白的可溶性，使蛋白质在大肠杆菌中可溶性表达，有利于蛋白纯化和活性的研究。大肠杆菌表达系统是目前基因工程中比较成熟、经典的表达方法。而PET表达体系则为该系统中的经典，本发明采用了pET载体作为蛋白表达载体，该载体的特点是带有Trx-tag，会产生Trx和目的蛋白的融合蛋白。

所述的重组表达载体的构建包括以下内容：pET-32a(+)载体的酶切；酶切产物的胶回收及纯化；目的序列和载体的连接；连接产物的鉴定。连接产物的鉴定包括：制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

针对于μ-芋螺毒素二硫键较多结构较复杂的特点，本发明优选大肠杆菌Origami2(DE3)为大肠杆菌宿主菌。Orgami2(DE3)为K-12衍生的宿主菌，具有硫氧还蛋白还原酶突变型(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)突变型基因，具有增加胞浆内二硫键的形成的特性。Orgami2(DE3)表达的活性蛋白量比其它大肠杆菌宿主菌高10倍以上，是表达富含二硫键蛋白的理想宿主。即使和其他大肠杆菌宿主菌的总体表达水平相似，Orgami2(DE3)表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Orgami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。

本发明对IPTG诱导目的蛋白的表达条件进行了优化和筛选，结果发现，初始菌浓度(OD₆₀₀)以及诱导时间对于蛋白表达量有着较为显著的影响，进一步的实验发现，当OD₆₀₀＝1.0左右时，蛋白表达量最高。当诱导时间为20h，蛋白的表达量增加率最高。