[发明专利]一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及有害生物的生物防治技术领域，特别是通过省略杀虫蛋白的提取和芽胞分离程序，直接将矿物加到发酵液中，伴胞晶体碱解生成的活性杀虫蛋白被矿物载体吸附，得到含有芽胞的苏云金杆菌杀虫蛋白吸附复合剂型。

【背景技术】

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种近缘于腊状芽胞杆菌、产生芽胞和伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的细菌，1938年法国出现了第一个苏云金杆菌制剂，20世纪中期实现了工业化生产，其产量占生物杀虫剂总量的97%，成为当前世界上产量最大、应用最广的一种生物杀虫剂，对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等数百种昆虫有防治效果。然而，苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、湿度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点，制剂贮藏稳定性差，田间残效期短。从实际应用效果上看，经过2-3天的日光照射，伴胞晶体即基本上失去活性。苏云金芽胞杆菌田间应用残效期短，已成为制约该杀虫剂发展的瓶颈，如何提高其杀虫效果是苏云金杆菌科研单位和生产企业所共同面临的难题。目前延长残效期的方法主要有：添加紫外线吸收剂、制备微胶囊包被、与化学农药复配，具有一定的实际效果，但尚未成为一种经济、环保、高效兼顾的理想手段。苏云金杆菌商业制剂是由伴胞晶体、芽胞和填料组成，其中伴胞晶体又称δ内毒素，是苏云金杆菌制剂的主要杀虫成分。伴胞晶体是否会在环境中积累与以下三种因素有关： （1）使用的浓度；（2）昆虫消耗的速度；（3）紫外光及土壤、作物表面微生物群对其钝化和降解的速度。上述三种因素中，环境降解是苏云金杆菌制剂活性下降的主要原因。研究发现，伴胞晶体酶解后释放的活性杀虫蛋白很容易被土壤矿物颗粒吸附, 而且一旦吸附完成，Bt杀虫蛋白就会对微生物分解产生抗性，杀虫活性持续的时间显著延长。吸附态Bt蛋白杀虫活性提高、持效期延长的性质为苏云金杆菌长效制剂研究提供了新思路。为此，国内有专利（ZL200510015282.3）提出了利用土壤矿物吸附固定杀虫蛋白的方法，使之能够抵御阳光、微生物和酶的降解。实践证明，这种吸附剂型具有活性高、持效期长的特点，但这种剂型是以苏云金杆菌伴胞晶体释放的原毒素为唯一杀虫成分，不含芽胞，因而缺乏芽胞的增效作用。其次，原毒素（分子量130 kDa）的杀虫毒力与活性杀虫蛋白（分子量65-70 kDa）相当，而分子量却比后者高出了一倍，空间位阻效应导致原毒素在土壤矿物上的负载量低于活性杀虫蛋白。经实验计算，原毒素在土壤矿物上的饱和吸附量仅为活性杀虫蛋白的71.0%-90.7%。原毒素蛋白在矿物载体上吸附量偏低，必然影响吸附制剂的单位质量效价。

为了提高苏云金杆菌吸附剂型的效价和降低制造成本，申请人在长期研究中发现，将苏云金杆菌发酵液中的伴胞晶体和芽胞不经洗涤直接碱溶，得到分子量较低的活性杀虫蛋白，生成的杀虫蛋白被预先加入的矿物载体吸附，不仅提高了杀虫蛋白在矿物载体上的吸附量，而且发挥了芽胞的增效作用，使吸附制剂的效价大幅度提高。由于省去了胞晶混合物的洗涤、离心分离等步骤，产品的制备成本降低。

【发明内容】   

本发明的目的在于改进现有苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，通过简化原毒素的提取制备程序，直接对发酵液中的伴胞晶体碱解，得到降解的活性杀虫蛋白。

本发明公开了这种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作：

（1）采用SDS-PAGE电泳法对苏云金芽胞杆菌发酵液中的伴胞晶体进行含量测定，计算发酵液中杀虫蛋白总量；

（2）取微米级矿物颗粒用水配置成重量与体积比为5.0%—20.0%的悬浮液，然后按照矿物：杀虫蛋白的质量比=10:1~1:15的比例将矿物悬液加入到苏云金芽胞杆菌发酵液中；

（3）将步骤（2）得到的苏云金芽胞杆菌发酵液升温至37-60℃，用浓度1mol/L NaOH溶液调节pH至 11—12，溶解4—6 h； 

（4）将步骤（3）得到的溶解液用浓度1mol/L HCl溶液调节pH至 6-8，并缓慢降至0℃-35℃，继续搅拌吸附1-10 h；

（5）将步骤（4）得到的吸附悬浮液进行离心浓缩，脱出上清液，即得到苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞的吸附复合剂型，冷冻保存。

所述矿物颗粒是2:1型层状矿物蒙脱土或累托石，2:1型层链状矿物海泡石或凹凸棒土，或1:1型非膨胀型矿物高岭石中的一种或两种以上的混合物。