[发明专利]玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学和基因工程领域，具体的说，涉及一个玉米poly(A)结合蛋白PAB5基因启动子的获得和植物表达载体的构建，尤其涉及诱导外源基因在花粉特异性表达和获得植物雄性不育系和恢复系。 

背景技术

玉米属禾本科玉米属。全世界玉米播种面积仅次于小麦、水稻而居第三位。玉米用作饲料、食物和工业原料，在许多地区作为主要食物。除食用外，玉米也是工业酒精和烧酒的主要原料。故对玉米的研究具有重要意义。 

花药是花粉发育的场所，植物雄性不育系是作物杂种优势利用的重要途径，因此对花药及花粉发育的研究具有重要的应用价值。杂交繁育是传统的将两种植物的所需遗传性状导入一种植物的传统方法。为了可靠的获得性状一致的杂种，应确保亲本系之一为雄性不育。产生雄性不育目前有多种技术，一种是人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗狀雄花，但该方法费力而且不完全可靠。另一种是利用基因工程来获得住屋雄性不育系和恢复系。 

外源基因能够在植物组织中特异高效的表达，必须要构建一个可以特异高效表达的植物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。以人为地可控制的方式在花粉中表达对花粉产生有影响的基因对雄性不育系统将是有用的，必要时可以恢复能育性。因此，对于花粉特异性表达启动子的研究具有很大的应用价值。 

发明内容

为了研究玉米花粉的发育机制以及转基因植物中标记的删除，同时为在花粉中特异性的表达外源基因，从而得到在花粉中特异表达的转基因植物，培育具有较高商业价值及保健价值的新品种。本发明提供一种在玉米花粉组织中特异性表达的启动子及其植物表达载体。 

本发明所提供的玉米花粉组织特异性启动子，名称为ZMP5 (poly(A) binding 

protein PAB5 gene promoter)，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）。

本发明所涉及的设计方案为，一种玉米花粉组织特异性启动子，通过生物信息学的方法筛选确定启动启动子序列，在玉米B73自交系中获得，通过在水稻中验证在花粉中特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1下的序列。通过玉米B73提取总DNA克隆获得的PAB5基因启动子，经测序其长度为2222bp。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。 

一种玉米花粉特异性表达载体，转入了上述的玉米花粉组织特异性启动子。 

本发明提供的一种玉米花粉组织特异性表达载体，转入了前述的玉米花粉组织特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米特异性启动子置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成在启动子的下游含有GUS报告基因的花粉特异性表达载体，命名为p-ZMP5。并形成愈伤组织；利用潮霉素筛选，得到转基因水稻。PCR结果表明玉米特异性启动子转入到水稻种；GUS组织化学染色鉴定证实PAB5基因的启动子为花粉特异性表达启动子，p-ZMP5为一种花粉特异性表达的载体。 

本发明的玉米花粉特异性启动子，通过驱动能干扰花粉产生或生存能力的基因而导致雄性不育，或在花粉粒中特异性表达目的基因。所述基因可以是对花粉或花粉生成有影响的基因，可以是参与控制雄性能育性的基因，编码杀昆虫毒素的基因，或可增强或修饰花粉的营养价值的基因。本发明的表达系统还可含有选择标记，如除草剂抗性基因或抗生素抗性基因，以根据种如玉米、水稻、小麦鉴定稳定的转化株，除草剂抗性基因的存在也可选择分离群体中的雄性不育子代。 

附图说明

附图1为转基因植株的GUS染色结果（在划分中呈现蓝色）。 

A为茎；B为根；C为叶；D为花粉；E为子房；F为颖壳；G为未成熟的种子； 

H为成熟的种子。

染色结果显示GUS基因在花粉中特异性表达，其他部位均不表达，D图中的蓝色斑点即为花粉。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由Invitrogen公司进行，PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，方法均参照试剂盒说明书进行。 

实施方式 

一、玉米花粉组织特异性表达的基因PAB5的获得