[发明专利]产胞外杀藻蛋白海洋细菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌的筛选方法，尤其是涉及一种运用高温失活处理和超滤处理来观察活性保留的变化情况，用以获得具有胞外蛋白活性的杀藻细菌的方法。

背景技术

水生生态系统中，微型藻类与细菌的关系越来越引起人们的重视。细菌对藻类的影响主要体现在：一方面细菌吸收藻类产生的有机物质，并为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子，从而调节藻类的生长；另一方面，细菌也可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从而表现为杀藻效应。

Middelboe等在研究富营养化的湖水发生的水华时发现，随着水华的发展，水体中细菌的细胞外分泌物的量增加1倍以上，而细菌胞外酶的活性也有显著增强。这表明细菌可能是通过细胞外分泌物和特殊的胞外酶而杀藻的。Loveioy等在澳大利亚分离到1株Pseudoalteromonas属细菌，该菌在3h内能导致赤潮藻Gymnodinium catenatum、Chattonella marina和Heterosigma akashiwo细胞裂解，进一步研究表明，该菌是通过向海水培养基释放活性物质而起作用。Doucette等分离到1株细菌Cytophaga 41-DBG2能产生一种溶解性杀藻复合物从而有效地杀死G.breve。

铜绿假单胞菌可产生大量的抗生素类物质如扩散性吩嗪色素物质，对其它细菌和藻类的生长都有抑制作用。Imai等在日本Hiroshima海湾发现4株Alteromonas属的细菌也可以杀死Chattonella antiqua。从Pseudomonas stutzer中提取出的“甲藻生长抑制剂(Dinoflagellate Growth Inhibitor，DGI)”活性较高，且毒性较稳定(4℃时3个月保持不变)，并且对鱼类无害，是比较理想的杀藻物质。关于杀藻机理，一股认为它通过作用于生理过程如阻断呼吸链，抑制细胞壁合成，抑制孢子的形成等方面，以达到抑制藻细胞生长或杀灭藻细胞的结果。

Lee等([1]Lee，S.O.，Kato，J.，Takiguchi，N.，Kuroda，A.，Ikeda，T.，Mitsutani，A.，Ohtake，H.Involvement of an extracellμLar protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66(10)：4334-4339)从1株能杀死硅藻(Skeleonema costatum)的Pseudoalteromonas sp.A28的培养液中提取并纯化到一种蛋白酶，该酶具有杀藻活性，进一步研究表明，该酶分子量大约50kDa， 其最适pH和温度分别为8.8和30℃。袁峻峰等([2]袁峻峰，孟智芳，陈德辉，葛东凌，章宗涉.中性柠檬酸菌对几种常见藻类生长的他感作用[J].淡水渔业，1999，29(4)：12-15.)从绿裸藻(Euglena viridis)水华中分离的优势菌种之一中性柠檬酸菌(Citrobacter intermedius)的分泌物对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、粉核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、羊角月牙藻(Selenastrum capricormutum)、水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)和易变鱼腥藻(Anabaena vqriabilis)的生长有促进作用；对银灰平裂藻(Merismopedia glauca)、莱茵衣藻(Chlamydononas reinhardii)和铜绿微囊藻(Microcystis aerugiuosa)的生长具有抑制作用。中性柠檬酸菌的胞外分泌物能促进粉核小球藻细胞个体的生长，对其它藻类主要是影响细胞的大小。Kodani等([3]Kodani，S.，Imoto，A.，Mitsutani，A.，Murakami，M.Isolation and identification of the antialgal compound，harmane(1-methyl-beta-carboline)，produced by the algicidal bacterium，Pseudomonas sp.K44-1[J].Journal of Applied Phycology，2002，14(2)：109-114)从日本东京Shinobazu池塘中分离到12株具有杀藻活性的细菌，9株属于Pseudoalteromonas sp.，其中K44-1的甲醇提取物具有明显的杀藻活性，进一步从中提取到1-甲基-β咔啉，当浓度在30μg disc^-1时能抑制几种蓝藻的生长。