[发明专利]一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗

权利要求书

1.一种EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒的制备方法包括：

(1)重组质粒的构建：用EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；

(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。

2.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述P1-pGAPZαA重组质粒是将P1蛋白基因与pGAPZaA质粒均用PmlI内切酶和SacII内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

3.按照权利要求1所述的EV7 1病毒样颗粒，其特征在于：所述3CD-pGAPZαA重组质粒是将所述3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和XbaI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

4.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述3CD蛋白酶基因和P1蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。

5.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3CD-pGAPZαA质粒转入SMD1168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，然后再将所述P1-pGAPZαA质粒转入3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株。

6.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述低浓度博莱霉素zeocin是指100μg/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500μg/ml浓度的博莱霉素。

7.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲溶液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15％、30％、45％和60％上，于28000转/分钟4℃离心1小时，收集15％-30％层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000转/分钟4℃离心2.5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。

8.一种手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括：(1)重组质粒的构建：用EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒，(4)制备疫苗：所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40μg/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。