[发明专利]一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛种苗生产方法，尤其涉及一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属珍稀濒危高附加值药材，其养生保健治疗效果确切，在《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》、2010年版《中华人民共和国药典》等医药典籍中均有记载。唐开元年道家经典著作《道藏》收录中华九大仙草(铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草)，因铁皮石斛滋阴补虚效果显著，被列为“中华九大仙草”之首位。李时珍《本草纲目》记载：“强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定智除惊，轻身延年。益气除热，健阳，逐皮肤风痹，骨中久冷，补肾益力。治发热自汗，痈疽排脓内塞。” 在2010年版《中华人民共和国药典》一部中单列，与其它环草石斛、马鞭石斛、黄草石斛、金钗石斛和鼓槌石斛等普通石斛种类区分，其功能与主治：“益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。”

因属濒危、珍稀、高附加值的资源性药材，铁皮石斛被列入《国家重点保护野生药材物种名录》(1987年)、《中国植物红皮书》(1992年)、《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录II。2010年，铁皮石斛生产技术及产业化再次被列入国家重点新产品计划和国家火炬计划的优先发展技术领域。铁皮石斛作为一种常用中药材，市场需求量较大，如何解决需求与资源之间的矛盾惟一的途径是人工栽培，采用植物组培技术。随着组织培养技术的发展和应用，铁皮石斛的组培技术已经基本成熟，但是组培无菌苗移入自然条件下成活率低，易染杂菌，这些都和缺少与之共生的菌根真菌有关。在自然状态下，兰科植物要与真菌共生形成菌根，才能使兰科植物健壮的生长。根据这个特点，我们自1992年开始从事铁皮石斛菌根真菌的分离、培养及铁皮石斛组培苗的菌根化方法的研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，使用该方法不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮，种植成活率高。

本发明采用的方法是先分别培养菌根真菌和细菌，再将菌根真菌及细菌与铁皮石斛茎诱导出的原球茎小芽共生培养，具体方法如下：

(1)菌根真菌的培养

将菌根真菌LP1菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于23~28℃(优选24~26℃)恒温培养10~15 d(优选11~13 d)，在菌落边缘打孔成菌片(优选Φ=8 mm)，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomium sp.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CPCC 480286；

菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的150~200 wt%(优选160~180 wt%)；高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2~3片菌片；真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；

菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物；菌根真菌的液体培养基用水配制，其中葡萄糖18~22 g/L(优选20 g/L)，KH₂PO₄ 18~22 g/L(优选20 g/L)，MgSO₄ 1.2~1.8 g/L(优选1.5 g/L)，维生素B₁ 8~12 mg/L(优选10 mg/L)，天然物：麦麸25~35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180~220 g/L(优选200 g/L)(使用其浸出液)，培养基pH 值为5.6~6.5(优选pH=6.0)；高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 mL培养基接入1~2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养，盛装量为50%，置于23~25℃振荡，转速100~120 rpm，培养20~30 d后收获；培养结束后得到液态菌根真菌，可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；

(2)菌根细菌的培养