[发明专利]一种产s-芳樟醇的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产s-芳樟醇的酵母工程菌及其构建方法，尤其是一种分子手段改造萜类生产(MVA)途径并异源引入s-芳樟醇合成酶，从而调控代谢流实现s-芳樟醇过量积累的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

芳樟醇(linalool)，又名沉香醇、芫荽醇，学名3,7-二甲基-1,6辛二烯-3-醇。芳樟醇属链状萜烯醇类，有α-和β-两种异构体，还有左旋(s)、右旋(l)两种光异构体。在不同的来源中，多为异构体的混合物。消旋体存在于香紫苏油、茉莉油中，或是化学合成的芳樟醇中；左旋体s-芳樟醇存在于芳樟油、黄樟油、香柠檬油、薰衣草油、玫瑰木油等精油中。

芳樟醇是重要的香料，用于花香型香精、香水、香皂和芳香工业等，是香水香精、家化产品香精及皂用香精配方中使用频率最高的香料品种。芳樟醇也是重要的化工原料，如用作维生素E和异植醇的合成前体。目前以松节油合成s-芳樟醇是最主要的生产方式，但存在很多问题，如合成线路长、副产物多且无法控制、有害中间产物残留等，严重影响了其使用的安全性。利用发酵法生产s-芳樟醇和其它单萜类化合物及其衍生物是一种可行的技术思路。萜类化合物的生物合成均来源于共同的前体——异戊二烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)。在酿酒酵母中，IPP是由乙酰辅酶A经过甲羟戊酸(MVA)途径生成的。IPP可以进一步生成香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)和法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，FPP)等异戊二烯二磷酸同系物，在特定的萜类合成酶和修饰酶作用下，最终形成种类繁多的萜类化合物。

代谢工程改造酿酒酵母生产s-芳樟醇国内未见有相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产s-芳樟醇的基因工程菌通过改造甲羟戊酸(MVA)途径引入来源于Actinidia arguta的芳樟醇合成酶，达到异源高效生产s-芳樟醇的目的。

所述酵母工程菌含有s-芳樟醇合成酶基因。

所述s-芳樟醇合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述s-芳樟醇合成酶基因克隆于PRS304。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产s-芳樟醇的基因工程菌基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1）优化genebank ID: GQ338153合成s-芳樟醇合成酶基因；

2）将s-芳樟醇合成酶基因与载体连接得到重组表达载体；

3）将重组表达载体转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)后得到基因工程菌。

下面是本发明技术方案的具体描述：

质粒及基因工程菌的构建：

根据NCBI公布的s-芳樟醇合成酶序列，经密码子优化后，进行全基因合成；将人工合成的s-芳樟醇合成酶基因克隆到整合质粒PRS304(购自德而宝生物技术有限公司，货号:YV8002）构建整合表达载体；将构建好的表达质粒转化酿酒酵母CEN.PK2-1C (MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3D 1; MAL2-8^C; SUC2)。PCR (F1:5’GGACTAGTATTATTCATGGCCAGCTTCAACAGG3’; 

R1: 5’CGGAATTCTATTACAGCATCTTTCGATACATC3’), 验证阳性转化子（含有1.9kbp条带）。

工程菌CEN.PK2 linalool的种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵g，亮氨酸0.2g，组氨酸0.2g，尿嘧啶0.2g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20琼脂，115 °C灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵g，亮氨酸0.4g，组氨酸0.4 g，尿嘧啶0.4g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20琼脂，115 °C灭菌20 min。