[发明专利]一种产角质酶基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

    一种产角质酶基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

    角质酶是一种多功能酶，属于丝氨酸酯酶的一种，既可水解长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯，还能参与酯化、转酯化等，由于角质酶的特殊结构，还可以水解角质。因此其在纺织工业、食品工业以及生物催化、化工工业等诸多领域有着广泛的应用前景。

    角质酶的发酵工艺研究主要集中在野生菌的培养条件优化以及对重组真菌角质酶采用不同的基因工程宿主细胞（如酿酒酵母、大肠杆菌和曲霉属）进行高效表达，优化生产工艺，降低生产成本等方面。但由于酵母培养成本高、生长周期长的缺点，以及F. solani pisi角质酶重组菌稳定性差的问题，至今未有角质酶工业化生产的报道。

    本实验室陈晟等（Chen S, Tong X, Woodard RW, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283（28）25854-25862）报道的Thermobifida fusca角质酶热稳定性好，pH稳定范围宽，最适作用温度60℃，最适作用pH 8.0，符合纺织用角质酶应用要求。在此基础上通过发酵优化，3L罐发酵30h，酶活达500U/mL（吴敬，吴丹，张瑶，陈坚，陈晟，一种重组角质酶的发酵工艺，中国专利，申请号200910259651.1）。但是存在两点不足：在复合培养基的基础上进行补料，成份复杂，不便于发酵调控；采用Ⅱ型分泌途径，两步跨越大肠杆菌内外膜，转运效率较低，发酵过程中通过加入一定量的甘氨酸改变细胞壁通透性来增加胞外分泌水平，这就增加了发酵生产成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产角质酶基因工程菌。

所述基因工程菌是通过构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E. coli BL21(DE3)。

所述产角质酶基因工程菌的构建方法如下：

1）以本实验室前期构建的Tfu_0883/ pET20b(+)质粒为模板扩增角质酶Tfu_0883基因；

2）以E. coli CFT073总DNA为模版扩增hlyAs的基因（中国专利申请200910260984.6）；

3）以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板， PCR扩增得到Tfu_0883-hlyAs基因；

4）pET20b(+)和Tfu_0883-hlyAs进行双酶切，割胶产物回收转化E.coliJM109感受态细胞，得到质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)；

5）重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)，得到大肠杆菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E. coli BL21(DE3)。

所述Tfu_0883/ pET20b(+)来源（Chen S, Tong X, Woodard RW, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283（28）25854-25862）

所述质粒pET20b(+)、菌株E. coli BL21(DE3) 购自Novagen公司，E. coli CFT073（ATCC 700928），购于ATCC。

本发明还要解决的技术问题是提供一种上述产角质酶基因工程菌发酵生产角质酶的方法。

为解决上述问题，具体生产方法如下：

1）发酵过程温度维持在36-38℃，通过增减搅拌转速或通入富氧空气使溶解氧维持20-40 %，通过补加氨水控制生长阶段pH 7.0-7.2、诱导产酶阶段pH 6.4-6.6；