[发明专利]一种利用LAMP法快速检测转基因玉米的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，特别涉及一种快速检测转基因玉米的方法，该方法利用环介导等温扩增反应(LAMP)检测转基因玉米中的抗草丁膦Bar基因。 

背景技术

转基因玉米作为目前世界上最主要转基因作物之一，自1996 年开始被大规模的商业化种植以来，世界各国已陆续开始种植，2007年种植转基因玉米的国家已经发展到15个，按种植面积依次为美国、加拿大、菲律宾、阿根廷、南非、西班牙、葡萄牙、法国、捷克、乌拉圭、洪都拉斯、德国、斯洛伐克、罗马尼亚和波兰。截至2007年，全球转基因作物种植面积高达1、1亿hm²，其中转基因玉米种植面积3520万hm²，占全球转基因作物种植面积的31%,仅次于转基因大豆。从世界范围看，转基因玉米的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。转基因玉米2007年市场价值达到32亿美元。然而转基因玉米在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性及对生态环境的安全性方面。因此，建立有效的转基因玉米快速检测方法，为进一步完善我国在转基因食品标识上的管理制度,同时在保护消费者知情权方面提供重要的技术保障。

目前，对转基因农产品采取的主要检测方法一是建立在核酸水平上的，包括PCR检测、多重PCR（Multiplex PCR）、竞争PCR（competitive PCR）、实时定量PCR（real-time PCR）、PCR-ELISA、核酸印迹法(Southern杂交)；二是建立在蛋白质水平上的Western 印记、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫试纸条。由于这些方法存在操作步骤繁琐，检测时间较长；不适合于现场实时检测和跟踪检测；检测成本过高；对检验人员的知识、操作水平和仪器水平要求过高等不足之处，方法较难普及。

Notomi 等在2000 年首次报道一种新的DNA 扩增方法，即DNA 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。该方法的基本特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，包括内引物（FIP 和BIP）和外引物（F3和B3），利用一种链置换DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件（60～65℃）保温1 h，即可达到l0^9-l0 个拷贝，完成核酸扩增反应，而且除了琼脂糖凝胶电泳，扩增产物也直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或者荧光染料进行判断是否发生反应。LAMP法广泛应用于包括DNA 病毒、RNA 病毒、细菌和寄生虫等传染性疾病的定性和定量检测，但在转基因检测的报道较少，特别是在检测转基因玉米领域应用较少。所以，科学研究和生产实践中均需要一种利用LAMP法快速准确、操作简便的转基因玉米检测方法。

发明内容

本发明提供一种利用LAMP法快速检测转基因玉米的方法，该方法利用环介导等温扩增反应(LAMP)检测转基因玉米中的抗草丁膦Bar基因。

该方法包括的步骤依次为：

A．配制反应体系；

所述的反应体系中包括：

Betaine 0.3-1.5mol/L，

dNTP 0.2-3.5mmol/L，

Mg²⁺ 2-18mmol/L，

内引物，外引物；所述的内引物和外引物的浓度之比为1-8：1；

该内引物的浓度为1.6-0.2μmol/L，该外引物的浓度为0.2μmol/L；

Bst DNA聚合酶大片段，Bst polymerse buffer， DNA模板， ddH₂O；

B．将所述的反应体系进行温育处理，得到温育产物；该温育处理的温度为65℃，时间为30-80min；

 C．将所述的温育产物进行灭活处理，得到灭活产物；该灭活处理的温度为80℃，时间为5-15min；

D．将所述的灭活产物进行检测，得到检测结果。

所述的外引物的核苷酸序列为： 

5’-ACGGGACTGGGCTCCA-3’

5’-ACCGGCAGGCTGAAGTC-3’

所述的内引物的核苷酸序列为： 

5’-GCAGCCCGATGACAGCGACCCTGCTGAAGTCCCTGGAG-3’

5’-GGATATGCCCCCCGTGGCACCAGAAACCCACGTCATGC-3’

本发明的有益效果为：

1. 本发明不需要特殊仪器（如PCR仪），较实验室常规律方法更快捷，经济。