[发明专利]制备抗蓝耳病转基因猪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物转基因技术，具体涉及一种制备抗蓝耳病的转基因猪的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与综合症病毒(PRRSV)所引起的一种传染性疾病。该病于1987年在美国首次发现，2006年我国部分省市猪群暴发高致病性蓝耳病，且该病毒与经典的蓝耳病病毒相比，基因发生了较大的变异，具有很强的致病性。

在PRRSV的大流行中PRRS造成的经济损失早已经为人们所熟知。据估计PRRS给美国养猪生产者造成的损失每年达5.6亿美元(Cho and Dee，2006)。我国是养猪大国，几乎占世界养猪总量的一半。随着猪集约化和规模化养殖的发展，猪的传染性疾病发病率增高，特别是近几年爆发的“无名高热病”等带来的损失都是每年以亿元为计算单位，给养猪业带来巨大损失，极大地挫伤了养猪者的积极性。同时，2007-2008年猪肉价格一涨再涨，以至使猪肉价格创历史最高记录，极大地影响了人们生活。

目前在病毒防治中主要采用疫苗，许多学者对PRRS病毒进行了较深入的研究，并在此基础上研制了弱毒苗、灭活苗和基因工程疫苗，试图通过免疫途径控制该病，但是由于蓝耳病病毒能导致猪持续感染、病毒血症及免疫性能低下，至今还没有能有效地控制PRRS的技术和措施。此外，PRRSV感染可引起机体的细胞免疫功能低下，而体内高水平的病毒特异性抗体又不足以清除病毒，造成病毒在猪体内的持续性感染(Pirzadeh and Dea，1998)，这给PRRSV的防治带来很大的困难，也对现行的免疫策略和疫苗研制手段提出了严峻的挑战。许多国家包括美国已将蓝耳病列为危害最大和控制最难的猪传染病。

RNA干涉(RNAi)是指双链RNA特异性诱导同源靶基因表达沉默的现象，它具有高度特异性，能快速引发转录后基因沉默。RNA干涉是由21～23个核苷酸组成的双链RNA引发的，小干涉RNA(siRNA)可以在体外化学合成，也可通过表达载体转录而成，它参与降解同源靶基因、抵御病毒入侵、抑制转座子等，将是基因功能研究、病毒防治、疾病治疗和品种改良等的有力工具。

研究证实，RNAi能够抑制病毒基因的复制、阻止病毒粒子的装配及影响病毒与宿主之间的相互作用，RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基因组序列，且siRNA能快速、高效、特异地降解同源mRNA而不产生任何副作用，从而成为抗病毒感染的有效手段。并在抗病毒研究方面已经取得了显著成效。

口蹄疫病毒(FMDV)是感染偶蹄动物的危险病毒。Kahana等针对所有FMDV的3个保守区设计了3个特殊的siRNA，细胞结果显示与对照相比，几乎显示了100％的生长抑制作用。Liu等针对FMDV基因组的保守区域5‘NCR，VP4，Vpg，POL，3’NCR设计了siRNA，转染后12h使BHK221细胞系FMDV的效价下降10倍，1000倍，且这种抑制作用可持续至转然后第6d。针对FMDV基因组的保守区设计的siRNA能抑制FMDV病毒的复制，是治疗高基因变化的FMDV病毒的新策略。

禽流感病毒H5N1已经在人类和禽类中引起了广泛的呼吸系统疾病，但目前的疫苗免疫和药物治疗都存在局限。Zhou等针对流感病毒基因组的保守区域设计了特异的siRNA(pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe-PB1)，受孕鸡卵和BALB/c小鼠中显示了明显抑制流感病毒的复制增殖。其中pBabe-NP抑制禽流感病毒增殖的特异性最好。RNAi技术提供了预防和治疗禽流感病毒在人类和禽类中传染的方法。

近年来，由虹彩病毒引起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲和澳洲等地普遍流行，真鲷虹彩病毒(RSIV)能引起海洋鱼类产生疾病。Dang等构建了靶向RSIV中编码病毒衣壳蛋白基因(MCP)的siRNA，在转染感染了病毒的细胞后的84h和94h后，对病毒MCP基因表达的抑制达到55.2％和97.1％。同时，病毒的增殖也被抑制了，表明针对MCP基因的siRNA干扰作用能特异和有效阻止RSIV的复制，是一种潜在的控制病毒感染引起的疾病的方法。显示了RNAi作为一种基因治疗的手段也可用于水生生物的病毒防治。