[发明专利]用于治疗重症肌无力的抗体靶向补体调节因子融合蛋白

权利要求书

1.一种乙酰胆碱特异性结合的单链抗体与补体抑制因子(DAF)的融合蛋白，其特征在于，应用分子克隆技术通过连接链(G4S1)3将乙酰胆碱特异性结合的单链抗体与补体抑制因子(DAF SCR1-4)在基因水平偶联，构建所得的融合蛋白在原核表达系统中高效表达。

2.制备权利要求1所述的乙酰胆碱受体特异性结合单链抗体与促衰变因子(DAF SCR1-4)融合蛋白的方法，按以下步骤制备：

1)scFv-DAF融合蛋白基因的克隆

以含有抗人AChR scFv1956#的质粒pHEN1为模板，用引物1和2在5’端加上酶切位点NdeI，并且在3’端引入连接序列：

引物1(5’引物，27nt)：5’TTT CATATG CAG GTC CAA TTT GTA GAG 3’；

引物2(3’引物，90nt)：5’ ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGCGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC TGC G

对抗人AChR scFv1956#进行PCR扩增的反应管的配置在冰浴中进行，加入模板、引物、dNTP、水和反应缓冲液后，温和混匀，94℃反应3min后加入Primer STAR酶，轻柔混匀后按照如下PCR扩增参数进行反应：94℃，变性反应1min；56℃退火反应1min；69℃延伸反应1min；上述三步反应进行28个循环后于72℃延伸5min，得到scFv-linker。

含有DAF cDNA的质粒RD37(NCBI Accession No.AB026902)为模版，用引物3和4在3’端加入BamHI酶切位点，并在其5’端引入连接序列：

引物3(5’引物，90nt)：5’GTC TGG AGG TGG GCC GCA GTC CGA TCC GCC ACC GCC AGA GCCACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC TGA ATT CAG ATC CTC TTC TGA GAT 3’

引物4(3’引物，28nt)：5’TTTT GGA TCC TCT ATG CAC TTG GGT GGT3’

PCR反应条件如下：94℃反应3min后加入Primer STAR酶，轻柔混匀后98℃，变性反应10sec；68℃退火、延伸反应1min；上述两步反应进行30个循环后于72℃延伸5min，得到DAF-linker。

上述PCR产物scFv-linker和DAF-linker经过胶回收纯化后，以1∶1的摩尔比混合作为模板用引物1、4进行PCR扩增，将scFv1956#与DAF用连接链在基因水平连接。具体反应条件为94℃反应3min后加入Primer STAR酶，轻柔混匀后98℃，变性反应10sec；68℃退火、延伸反应2min；上述两步反应进行15个循环后于72℃延伸5min。所得PCR产物用NdeI和BamHI双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收的目的片段命名为scFv-DAF。纯化后的融合蛋白片段scFv-DAF与NdeI-BamHI酶切处理过的质粒载体pMD18-T simple连接过夜，连接产物转化JM109，次日挑取阳性克隆，2×YT培养过夜，提取质粒DNA。对酶切鉴定插入大小正确的scFv-DAF原核基因克隆载体进行DNA测序分析，测序正确者命名pMD18T-scFv-DAF，其中含有编码特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体与补体调节因子(DAF)融合蛋白的基因。

2)表达载体的构建及融合蛋白的诱导表达

测序正确的pMD18T-scFv-DAF经过NdeI和BamHI消化后，胶回收约1600bp的DNA片段，与经上述限制性内切酶酶切后的质粒pET16b连接，转化感受态BL21(DE3)pLyss细胞。随机挑取的克隆经过NdeI和BamHI双酶切鉴定，正确克隆接种于5ml的2×YT中37℃活化8小时，随后以1∶200比例接种2×YT培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素)，37℃继续培养到中对数生长期OD600＝0.6时加入1mM的IPTG，持续诱导4小时后离心10,000rpm 4℃20min集菌，弃去上清，-40℃冻存菌体备用。

3)融合蛋白的纯化

用裂菌液(50mM PBS，0.5M NaCl，1mM EDTA，pH 7.5)重悬菌体，并在冰浴中超声裂菌，离心13,000rpm 4℃20min后弃上清。用洗涤缓冲液(20mM PBS，1％Triton X-100)重悬、超声、离心处理所得包涵体，用变性缓冲液溶解(50mMPBS，6M盐酸胍，5mM咪唑pH 7.5)沉淀，并在37℃震摇2小时。变性缓冲液平衡螯合了镍离子的Hitrap chelating HP columns(1ml柱体积，GE Healthcare)，以1～2ml/min流速上样。用10倍柱体积的缓冲液A(100mM咪唑，8M尿素，20mM PBS，pH 7.5)去处非特异性结合的杂蛋白。用缓冲液B(1M咪唑，8M尿素，20mM PBS，pH7.5)洗脱结合的目的蛋白scFv-DAF。上述实验所用缓冲液过柱前，都用0.45μm滤膜过滤后加入2mM的β-巯基乙醇。按1ml每管的量收集洗脱液，以Bradford法测定蛋白浓度(0.1％BSA为标准品)，合并蛋白峰。

4)融合蛋白包涵体复性

纯化后的包涵体用优化的阶段透析法重折叠：透析比1∶100对折叠缓冲液A(8M尿素，20mM Tris碱)透析八小时。用折叠缓冲液A稀释纯化后包涵体到1mg/ml的浓度，并加入100mM的β-巯基乙醇。继续用1∶100的缓冲液B(4M尿素，20mM乙醇胺)透析八小时，换用缓冲液C(2M尿素，20mM乙醇胺，250mg胱氨酸)继续透析八小时，最后对缓冲液D(2mM半胱氨酸，0.2mM胱氨酸，20mM Tris碱)透析八小时，其间更换一次缓冲液，上述透析过程均在4℃条件下温和搅拌中进行，最终得到的溶液通过超滤的方法浓缩。以Bradford法测定蛋白浓度。

5)融合蛋白体外的生物学活性检测

检测融合蛋白scFv-DAF的乙酰胆碱受体(AChR)结合能力及其抑制补体激活的能力分别通过ELISA和经典的溶血法来测定。

6)融合蛋白在细胞水平的补体攻击保护试验

选择人横纹肌肉瘤细胞TE671细胞作为靶细胞，其表面提供AChR作为融合蛋白scFv-DAF的靶向位点。用针对AChR的单抗mAb35来致敏TE671细胞，随后用200ng/ml的DAF和融合蛋白scFv195-DAF与致敏的TE671细胞37℃孵育40分钟，随后用PBS润洗三遍去除未结合的蛋白。用豚鼠血清作为补体来源攻击致敏及重组蛋白孵育后的TE671细胞，随后用4％多聚甲醛固定，伊文氏蓝(衬染细胞)稀释的FITC-C3抗体染色4℃过夜，次日用荧光显微镜观察细胞表面的C3沉积形态和数量的变化来比较DAF和scFv-DAF的保护力。