[发明专利]一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。

背景技术

登革病毒属黄病毒属，为单股正链RNA病毒，可导致登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。登革病毒病每年约有5-10千万人感染，已成为全球公共卫生关注的焦点之一。本病感染潜伏期为2～15天，平均5～6天，通常3～5天，发病前尽管体内有病毒存在，而前驱症状却不明显。登革热表现为突然起病，畏寒、迅速发热等症状。登革出血热有典型登革热表现，2～4病日内可见散在出血点。病情进展中有鼻腔、牙龈、消化道、泌尿道或子宫等任何一个以上器官的较大量出血，常见肝肿大，脑出血的病例也有发现。异常严重出血的病例可导致死亡。登革休克综合征具有DHF表现的少数病人，在发热过程中或热退后，病情突然加重，出现皮肤湿冷、脉数弱、烦燥或昏迷，血压下降出现休克或脉压低于2.67Kpa(20mm汞柱以下)等危象，甚至血压和脉搏测不出，病情凶险，病死率高。

登革热的诊断目前主要采取病毒分离定型以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定的方法。但由于患者早期抗体阳性率低，往往要7-10d后IgM抗体才能达到一个较高的水平，因此在早期诊断中受到一定的限制。近年来发展起来的荧光定量RT-PCR技术可实现早期诊断，而且与常规PCR相比，荧光定量PCR方法更灵敏，且不需要电泳分析，同时因加入特异的荧光标记探针可对PCR扩增产物进行实时检测，因而更省时、特异，减少了交叉污染，并能精确地对多个样本进行定量分析。

在以往的研究中有在登革1型病毒3’非编码区(3’NC)、NS5区、衣壳蛋白(C)区域设计引物探针。目前一般认为3’NC和NS5区设计的引物探针敏感性较差；C区保守性较差，设计出来的引物探针容易受到其它三型登革病毒的干扰；E区变异性很大，会出现假阴性或者敏感性较差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种登革1型病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒对登革1型病毒具有特异性和敏感性好的优点。

本发明解决上述问题的技术方案具体是：一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、一对特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物、荧光探针、荧光定量聚合酶Premix Ex Taq^TM和参比染料ROX Reference Dye II组成，其特征在于：

(1)所述的引物是特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物，其中，

上游引物序列为：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列为：5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的荧光探针序列为：

5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ NO.3)，

其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，Eclipse为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；

(3)所述的定量阳性模板为含有下列DNA片段的pMD18-T重组质粒：

GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA(SEQ NO.4)。

本发明所述的特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物可以由本领域常用的方法合成。

本发明所述的荧光探针可以由本领域常用的方法合成。

本发明所述的荧光定量聚合酶Premix Ex Taq^TM由Takara公司提供、参比染料ROXReference Dye II由Takara公司提供。

本发明所述的定量阳性模板的构建方法是将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体中构建重组质粒得到。

上述方法中，所述的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质粒载体而定。

登革病毒非结构蛋白NS2A可能参与多聚蛋白的水解过程，本发明人通过Clustal W2对不同株的登革病毒基因进行比对，发现四型登革病毒在NS2A基因处的差别较大，而且与其它黄热病毒之间也存在很大差别，同时登革1型病毒型内的NS2A基因则比较保守，本发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断病人是否被登革1型病毒感染，扩增的引物序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2，其位置如图1示。