[发明专利]一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱糖衍生物的技术方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成喜树碱衍生物的技术方法，尤其是一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱糖衍生物的技术方法，属于生物技术领域。 

背景技术

喜树碱（camptothecin，CPT）是从珙桐科植物喜树中分离得到的一种天然生物碱。喜树碱及其衍生物具有独特的作用机制——唯一具有选择性抑制DNA拓扑异构酶I（Topo I )，因此近20多年来成为了抗肿瘤药物研究的热点之一。由于喜树碱的水溶性和脂溶性均较差，其钠盐的抗癌活性较低，临床应用收到了严格限制。其后人们从喜树中分离出10-羟基喜树碱，合成了毒性小、抗肿瘤作用更强的喜树碱衍生物，在肿瘤防治中起到了重大作用。目前已经应用于临床的喜树碱类衍生物，例如于1994年在日本批准上市用于治疗结肠直肠肿瘤伊立替康（Irinotecan）、1996年美国FDA批准上市的拓扑替康（Topotecan）和2004年韩国批准上市的贝诺替康等，相关的药理实验证明，其他一些喜树碱类衍生物在临床上显示了良好的抗肿瘤活性。

喜树碱衍生物天然存在于喜树碱中的含量非常低，因此目前主要是以喜树碱为原料经过生物转化法、化学全合成以及化学半合成的方法来获得。化学全合成的方法由于反应步骤过多，合成总收率低，成本高，而无法实现产业化。而一些生物合成的方法虽然具有一定的经济效益，但仍存在转化率较低、菌株培养技术要求高，分离步骤多等缺点，因此其发展受到了限制。由于植物内生菌分布广，种类多，且易培养、易控制和生长快等特点，还可以产生具有生物活性的代谢产物，因此，通过人工的方式，诱导植物内生菌合成喜树碱衍生物，可作为喜树碱及其衍生物这一类抗癌成分的合成途径，为喜树碱及其抗癌作用、抗癌药物的研究提供参考。

臭马比木今年来是除了喜树之外的喜树碱的另一主要来源，因其全树富含喜树碱而引起了关注，已有开展相关研究，如专利“从马比木分离的喜树碱骨架化合物及其作为新药物及治疗剂的合成子的用途”（ZL97194492.X）、“从臭马比木中提取喜树碱的方法”（200810028740.0）、《喜树与喜树碱开发利用进展》冯建灿等，《林业科学》，2000年，36卷第5期）等，但鲜见通过人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱及其衍生物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工诱导臭马比木内生菌合成喜树碱糖衍生物的技术方法，该方法通过将臭马比木未成熟的细胞按照一定比例，置于特定培养基中培养，在细胞指数生长初期，加入组合诱导子和糖，再加入糖化试剂和催化剂，进行糖化反应，最后在细胞指数生长中期，再加入组合诱导子对臭马比木内生菌进行诱导，实现喜树碱糖衍生物的合成。

本发明所采用的技术方案是：

（1）制备扩增培养基，即在MS基本培养基的基础上添加萘乙酸50~80μmol/L、6-苄氨基嘌呤5~10μmol/L、蔗糖或葡萄糖30~50g/L、琼脂1.5~2g/L；pH5.5~6；将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为50~200g/L湿重的比例，置于扩增培养基中，在25~30℃中培养；

（2）制备组合诱导子：由0.02~0.04mol臭马比木内生菌诱导子、60~80g/L水杨酸，20~60过氧化氢和80~100μmol/L甲基茉莉酮酸组成；

（3）诱导培养：在细胞指数生长初期，加入浓度为1~2000μmol/L的组合诱导子和20~50g/L的糖；加入糖化试剂和催化剂，进行糖化反应；在细胞指数生长中期，再加入浓度为1~2000μmol/L的组合诱导子进行诱导。

本发明相对于现有技术的优点在于：采用人工诱导的方式，利用产喜树碱植物臭马比木内生菌的特性，实现喜树碱衍生物的合成，可解决目前一些生物合成的方法仍存在转化率较低、菌株培养技术要求高，分离步骤多等问题，可为喜树碱及其抗癌作用、抗癌药物的研究提供参考。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1  

(1) 培养基制备：MS基本培养基中添加萘乙酸50μmol/L、6-苄氨基嘌呤5μmol/L、蔗糖或葡萄糖30g/L、琼脂1.5g/L；pH5.5~6；

(2) 接种培养：将臭马比木未成熟的细胞按照接种量为100g/L湿重的比例，置于25℃摇床，转速80rpm，暗培养；

(3) 组合诱导子：由0.02mol臭马比木内生菌诱导子、60g/L水杨酸，20μl/L过氧化氢和80μmol/L甲基茉莉酮酸组成；