[发明专利]一种纳米基因导入材料

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因导入材料

背景技术

基因导入系统或方法可以分为两类：病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。由于病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如病毒转染有可能激活原癌基因等，故非病毒型转染方式是目前的研究热点，在上述非病毒式转染中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结果不稳定；仅阳离子脂质体法表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种纳米基因导入材料，具有良好的细胞相容性、低毒、稳定且较高的转染效率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种纳米基因导入材料，由HAuCl₄和N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其中HAuCl₄与N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺的比率为1∶4。

与现有技术相比，本发明具有以下的优越性：(1)具有较高的转染效率，在人血管平滑肌细胞中可以达到40％左右；(2)低毒性，因AuNPs/氨基硅烷纳米的复合材料具有良好的生物相容性，细胞生存率很高；(3)材料分散性良好，符合对转染的要求；(4)非常低的成本，氨基是食品添加剂，成本很低，另外实验中使用的化学药品，氨水都是常见廉价试剂；(5)材料制备反应简单易操作，可重复性好。

附图说明

图1为AuNPs/氨基硅烷纳米的扫描电镜图片。

图2为AuNPs/氨基硅烷纳米的投射电镜图片。

图3为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。

图4为转染后的细胞生存率图片。

图5为转染效率图。

具体实施方式

一、材料的制备

1、主要材料

四水合氯金酸(HAuCL₄·4H₂O)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯，为上海国药集团化学试剂有限公司生产。N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为Alfa Aesar，公司生产，纯度为90％。所有试剂使用前没有进行进一步的纯化。

2、材料的制备

10mL具塞锥形瓶中加5mL DMF，加50微升0.1M HAuCl₄水溶液加3.6微升SiEN，搅拌均匀后放入60°烘箱中加热20h。冷至室温后，产品离心(15000rpm，5min)，EtOH洗3次。

二、结合性能的测定

1、主要材料

绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)；HEPES平衡盐溶液(自配)；电泳缓冲液(0.5×TBE，自配)；DNA上样缓冲液；溴化乙啶(EB)。

2、主要方法

1μL AuNPs/氨基硅烷纳米溶液(5mg AuNPs/氨基硅烷纳米溶解在500μL双蒸水中)与1μLpEGFP-C1水溶液(0.1μg/μL)以及8μl双蒸水(pH＝7.4water)在1.5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。AuNPs/氨基硅烷纳米和pEGFP-C1的质量比分别用100∶1，50∶1，30∶1，10∶1，1∶1。在5000rpm的速度下离心5min。将沉淀物加载到1％的琼脂糖(EB_0.1μg/mL)在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。

3、结果

请参阅图1和图2，结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-C1有多种构型所致。在质量比10∶1，1∶1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结合不是很好，到了100∶1，50∶1，30∶1条带消失，说明结合完全了。

这些结果表明：带正电荷的pEGFP-C1和AuNPs/氨基硅烷纳米有一个最佳的结合比，超出30∶1以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以使用30∶1进行转染。

三、转染

1、主要材料

人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)；AuNPs/氨基硅烷纳米@pEGFP-C1联合体(上述制备)；DMEM培养基；胎牛血清FBS；6孔培养板。

2、主要方法