[发明专利]农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效基因转化方法。

技术背景

转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。通过基因工程技术将外源基因导入植物细胞是现代遗传育种的重要途径，外源基因转化，整合到受体植物细胞基因组中是植物基因工程的重要环节。但目前研究的瓶颈在于遗传转化的效率，因此高效遗传转化方法的研究在生物工程领域中尤其重要。

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，1970年人们发现它是植物致瘤的起因，它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，植物细胞被侵染后形成肿瘤，能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌，诱发毛状根的称为发根农杆菌。其中根癌农杆菌在转基因技术中的应用相对较多。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA(T-DNA)，具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。

根癌农杆菌一植物DNA转移步骤包括：1)植物敏感细胞和根癌农杆菌的相互作用。植物受伤后产生大量对根癌农杆菌感染敏感的细胞。受伤细胞产生一些低分子量的酚类物质可以明显刺激根癌农杆菌Ti质粒上的Vir区基因表达，其中刺激效果较好的两种分子为乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这两种化合物是由代谢活跃的受伤细胞特异合成和分泌的。根癌农杆菌染色体上的基因是细菌体内持续表达的基因，大多编码一些膜相关蛋白，植物受伤后水解生成的单糖与根癌农杆菌相应蛋白结合，使细菌向植物受伤细胞趋化移动。另一些基因编码的蛋白帮助细菌附着于植物受伤细胞。2)Ti质粒毒性区基因的激活。农杆菌附着到植物受伤细胞后，Vir区基因的激活主要通过VirA-VirG二元调节系统进行。植物分泌的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮信号分子与VirA蛋白结合并激活VirA蛋白，VirA蛋白又使VirG蛋白磷酸化结构改变而被激活，激活的VirG蛋白对VirG基因本身也有诱导作用，结果产生一种放大式的瀑布效应，然后VirG蛋白与各毒性区5’端非转录区的“毒性盒”序列相结合，启动各毒性区的转录。后来人们发现，在缺少乙酰丁香酮的情况下，一些小分子量的糖类，如半乳糖和葡萄糖，也可极大促进Vir区基因的表达。这说明Vir区基因的表达受酚类化合物和糖类的双重调节。VirH有两个基因，其编码的蛋白与细胞色素P450酶相似，可能对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制，可增强附着和致癌能力。3)T-DNA的切割和T-复合体的生成。在Vir区，VirD编码两种蛋白VirD1，VirD2。VirD蛋白与T-DNA的加工有关，它决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。切割分两步进行：首先是VirD1与25bp边界序列亲合结合使边界序列松弛，然后是VirD2在特异位点剪切。VirD2至少有两个功能，一是特异剪切，并与T链5’端共价结合；二是作为核定位信号的导向功能，即引导T链进入植物的细胞核。VirC编码两种蛋白VirC1及VirC2，VirC1蛋白可特异地与章鱼碱型Ti质粒上的超驱动序列结合，从而促进T-DNA边界序列的缺口剪切。VirC2的功能目前尚不清楚，但VirC2突变能导致缺刻形成的减少，因此它可能也对缺刻形成有一定贡献。T-DNA链必须横向跨越细菌细胞膜、植物细胞膜及核膜，才能整合进植物基因组。在整个运转过程中，T-DNA链必须被保护形成T-DNA-蛋白复合体才能避免被核酸酶降解。4)T-复合体由根癌农杆菌经细菌细胞膜进入植物细胞膜。经过包被，有了核定位信号，有了助推蛋白T-复合体要实现转移的第一个关口是细菌细胞膜。这需要形成跨膜通道，需要有跨膜或膜结合蛋白的参与。VirB操纵子的各个基因在T-复合体穿过细菌膜而运转中起着重要作用。章鱼碱型VirB区有11个开放阅读框架。按功能可将VirB蛋白分成五类：A：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T-复合体的受体。B：蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促使T-复合体被泵出细菌细胞。C：起形成通道的作用。S：载体蛋白，起运载T-复合体穿过通道的作用。P：位于外膜上作为结合植物细胞膜的一种受体。从它们的氨基酸序列推导它们编码的蛋白质具有穿膜或膜相关蛋白的特性。5)T-DNA整合到植物染色体上。T-DNA整合的过程类似于在哺乳动物细胞中发现的非正常重组。非正常重组包括两个基本步骤：I.DNA末端的生成；II.DNA末端再连接。DNA非正常重组有几个特点：a.T-DNA瞄准整合的位点没有序列特异性。从理论上讲，T-DNA整合可以在植物染色体上的任何部位发生，T-DNA整合位点随机分布于植物基因组。b.整合部位的植物DNA有一小段与T-DNA端点附近区域同源的序列，这种序列一般只需要几个碱基的长度。C.在重组发生部位可能找到一些额外的核苷酸序列，它们被称作填充DNA。T-DNA可以一到多拷贝插入植物基因组。