[发明专利]微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯及菌株

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯，以及筛选到的可用于催化该反应的新菌株。

(二)背景技术

4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的有机中间体，分子中有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是非常有前景的重要的手性砌块，还可经由氯基的置换、还原等反应，导入其他基团生成所需的手性药物中间体，可用于合成L-肉碱、大内酰亚胺和(R)-γ-氨基-β-丁酸，还可以转化生成(+)-负霉素和手性2，5-环己二烯酮的合成子。

S-3-羟基丁内酯是降血脂药物阿托伐他汀、HIV蛋白酶抑制剂氨普那韦、饱感剂(2S，4S)-2-羟基-4-羟甲基-4-丁内酯、治疗皮肤病药羟基二十碳四烯酸、抗癌药aplysistatin等关键中间体。

R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的化学结构为：

S-3-羟基丁内酯的化学结构为：

这两种手性中间体，已经成研究热点。利用生物催化法制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯具有反应条件温和，立体选择性高，环境友好等优点，目前文献报道的手性4-氯-3-羟基丁酸酯制备方法主要有以下几种：

日本Suzuki等(Suzuki T，Idogaki H，Kasai N.Dual production of highlypure methyl(R)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactone with Enterobacter sp.[J].Enzyme and Microbial Technology，1999，24：13-20)筛选到一株肠杆菌Enterobacter DS-S-75，对外消旋4-氯-3-羟基丁酸甲酯进行不对称转化，可以同时得到e.e.大于99％的(R)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯和e.e.为95.9％的(S)-3-羟基-γ-丁内酯，两个对映体的收率均达到48％。

Hoff等(Hoff B，Anthonsen T.Lipase-catalyzed resolution of esters of4-chloro-3-hydroxybutanoic acid：effects of the alkoxy group and solvent onthe enantiomeric ratio[J].Tetrahedron：Asymmetry，1999，10(7)：1401-1412.)在溶剂苯中，以丙酸乙烯酯为酰基供体，Rhizomucor miehie脂肪酶催化4-氯-3-羟基丁酸乙酯不对称转酯化，较成功地拆分了4-氯-3-羟基丁酸乙酯，两个对映体的光学纯度均大于85％e.e.。

金勇(金勇，吴坚平，徐刚，等.有机相酶催化氨解反应拆分制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[J].有机化学，2006，26(10)：1384-1388.)用商品化的脂肪酶Novazym435，以二氧六环作溶剂，利用氨基甲酸铵缓慢分解持续释放NH₃，不对称氨解拆分4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

敬科举等(敬科举.双重组菌耦合不对称还原生产(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究[D].浙江大学博士论文，2005.)分别从褚色掷抱酵母和木兰假丝酵母中克隆得到醛基还原酶基因(ALR)和碳基还原酶基因(CAR)，并分别将它们构建到大肠杆菌中，获得了重组菌。用这两个重组菌催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原，分别得到单一手性的(R)-和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，e.e.值均为100％。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株筛选到的能够催化合成R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯的新菌株——巨大芽孢杆菌WZ009，以及利用该菌株所含的酯水解酶不对称转化外消旋4-氯-3-羟基丁酸酯制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯的方法。

本发明采用的技术方案是：

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WZ009，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNO：M 2010171，保藏日期：2010年7月8日。