[发明专利]一种同时制备毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷化学对照品的方法

说明书

技术领域本发明涉及一种同时制备毛蕊异黄酮苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)、芒柄花苷(Ononin)化学对照品的制备新工艺。主要包括硅胶柱色谱富集、树脂柱除杂及反相高效液相制备色谱三步纯化。

背景技术

黄芪为临床常用中药，有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效，所含的皂苷和黄酮类成分为其主要活性成分。毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷是黄芪中含量较高的两个黄酮苷类化合物，2010版中国药典已将毛蕊异黄酮苷作为黄芪的质控指标成分之一。由于该化合物极性较大，获取高纯度对照品较为困难，因此市场上该对照品价格昂贵(1250-1800元/10mg)，且经常处于缺货状态。黄芪为临床大宗药材，使用量较大，缺少高纯度对照品严重影响了黄芪等相关制品的质量评价、生产销售及制约了相关新药的研发步伐。发展高纯度毛蕊异黄酮苷及芒柄花苷的高效制备方法，尤其规模化制备技术具有重要意义。

目前，从黄芪中制备黄酮苷类化合物的报道较少，中国专利(CN00710176318.5)报道采用萃取、树脂层析富集及反复重结晶等获取纯度约为97％的毛蕊异黄酮苷，其中重结晶的次数为5-7次，过程较繁琐且重结晶损失量较大。而同时获取规模化毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的制备研究未见文献报道。

发明内容

本发明旨在提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以黄芪粗提物为原料，同时制备纯度大于98％的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷两种化学对照品，制备规模为克级到10克级。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

1)硅胶柱色谱富集：

黄芪醇提物，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯、甲醇混合溶剂洗脱，洗脱物减压干燥得棕黄色粉末；

2)树脂柱除杂：

棕黄色粉末用低浓度乙醇溶液溶解，树脂柱分离，先以水溶液洗脱除去杂质，乙醇溶液台阶梯度洗脱，其中乙醇的体积分数为25-55％，分别收集25-35％洗脱物(毛蕊异黄酮苷粗品)，45-55％洗脱物(芒柄花苷粗品)；

3)反相高效液相制备色谱精制：

上述粗品用体积分数为40-60％的甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相高效液相制备色谱分离，以甲醇-水溶液为洗脱体系，紫外检测器254nm监测，收集各自制备图谱中主要的色谱峰，干燥即可得到纯度大于98％的两个对照品，其外观为白色粉末。

所述步骤1)的具体过程为，硅胶柱色谱采用的洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂，其比例为9∶1-7∶3。

所述步骤2)的具体过程为，树脂柱上样样品用体积分数不高于25％的乙醇溶液溶解，采用的树脂为HPD 100或Diaion，各台阶梯度洗脱的体积为3-5倍柱体积。

所述步骤3)的具体过程为，制备高效液相采用的流动相为体积分数为40-50％的甲醇水溶液。

以本发明从天麻中分离毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪甲苷化学对照品具有如下优点和进步：

1)本发明工艺简单、收率高，且可同时获取两个高纯度对照品。

第一步采用硅胶柱富集，可直接将黄芪中的脂溶性苷元和苷类分开，同时除去部分强极性杂质；第二步采用树脂柱除杂，可获取含量约为80％(HPLC归一化法)的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷粗品，同时树脂有脱色的功效。第三步采用反相高效液相制备，可获取高纯度对照品，且收率较高(＞85％)。

2)本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。

原料要求不高，一般市售粗提物即可，易于批量备料；第一步粗分离采用硅胶柱富集，填料便宜易得；第二步采用树脂柱除杂，树脂柱可以再生循环使用且树脂价格低廉，易于规模化；第三步精制中采用反相高效液相制备，发展的制备方法为快速的等度方法，也非常适宜放大规模生产。

附图说明

图1为经硅胶柱富集后毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的HPLC分析图谱(254nm)

图2为经树脂柱除杂后毛蕊异黄酮苷的HPLC分析图谱(254nm)

图3为经树脂柱除杂后芒柄花苷的HPLC分析图谱(254nm)

图4为高纯度毛蕊异黄酮苷的HPLC分析图谱(254nm)

图5为高纯度芒柄花苷的HPLC分析图谱(254nm)

具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

1)硅胶柱色谱富集：