[发明专利]一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因和应用。

背景技术

植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，结构复杂。植酸分子含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。单胃动物饲料中通过添加植酸酶，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。

植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。当饲料中存在足量的植酸时，添加适量植酸酶可以替代部分补加的无机磷酸盐。同时也避免植酸磷与动物体内的多种金属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，而导致动物对这些营养元素无法有效利用。

随着生物技术的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于Escherichia coli，Aspergillus niger、Aspergillus fumigatus、Selenomonas ruminantium等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到表达。但是，颗粒饲料生产中需要经历一个短暂的高温阶段，一般在85-95℃。植酸酶本身就是一种蛋白质，在高温条件下会变性失活。现在大多数商品植酸酶都不能耐高温，高温制粒过程造成酶活的急剧下降，无法满足实际应用要求。如何使植酸酶既能短暂耐高温又能在动物体中具有高酶活是目前饲料用植酸酶制剂急需解决的一个问题。

来源于大肠杆菌植酸酶APPA具有高比活性的优点，并且已经被克隆并测序(The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2.5 Acid phosphatase and glucose-1-phosphatase.Journal of Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500)该基因全长1299bp，编码432个氨基酸。N端的22个氨基酸为信号肽。APPA的最适温度为60℃，但其热稳定性较差，在60℃下保温10分钟其剩余酶活性别仅为50％，在80℃下保温10分钟其剩余酶活性在15％以下，因此，在动物饲料制粒过程中酶活性损失过大，剩余不到20％的活性，使得其在具体的应用中受到限制，因此如何利用基因工程的手段来提高其热稳定性，是解决其应用的关键点。

发明内容

本发明的目的是通过对大肠杆菌植酸酶APPA的改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良，最终达到工业化生产的要求。

本发明的目的是提供一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因。

本发明的再一目的是提供一种优化改良大肠杆菌Escherichia coli的植酸酶APPA耐热性的方法。

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种表达植酸酶PHYTH的方法。

本发明的再一目的是提供上述植酸酶PHYTH的应用。

大肠杆菌植酸酶APPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MKAILIPFLS LLIPLTPQSA FAQSEPELKL ESVVIVSRHG VRAPTKATQL

MQDVTPDAWP    60

TWPVKLGWLT PRGGELIAYL GHYQRQRLVA DGLLAKKGCP QSGQVAIIAD

VDERTRKTGE    120

AFAAGLAPDC AITVHTQADT SSPDPLFNPL KTGVCQLDNA NVTDAILSRA

GGSIADFTGH    180

RQTAFRELER VLNFPQSNLC LKREKQDESC SLTQALPSEL KVSADNVSLT

GAVSLASMLT    240