[发明专利]一种酸性β-甘露聚糖酶VMAN及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性β-甘露聚糖酶及其基因和应用。

背景技术

甘露聚糖是豆类、谷类中普遍存在的一种植物半纤维素，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，具有高吸水性。饲料中所含的甘露聚糖在单胃动物的消化道内大量吸水，使食糜粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。

目前，一般选用大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母作为β-甘露聚糖酶基因的表达宿主。由于在大肠杆菌中表达产量较低，蛋白易形成包涵体，产业化生产困难。因此采用真核生物，如酿酒酵母和毕赤酵母等作为表达宿主成为当前的主要趋势。如双孢菇(Tang C M，et al..The cel4 gene of Agaricus bisporus eneodes a β-mannanase.Appl Environ Microbiol，2001，67(5)：2298-2303.)、贻贝(Xu Bingze，Sellos D，Janson J C.Cloning and expression in Pichia pastoris of a blue mussel(Mytilus edulis)β-mannanase gene.Eur J Biochem，2002，269：1753.)、芽孢杆菌(谭秀华等.耐碱性甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达.微生物学报，2005，45(4)：543-544.)来源的甘露聚糖酶基因分别在毕赤酵母中得到成功表达，表达的酶活力分别为3.3U/ml、41.04U/ml、41.8U/ml。乔宇等将来自枯草芽抱杆菌的甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中表达，最高酶活可达1102IU/ml，表达量为1mg/mL(乔宇，陈小兵，丁宏标，岳明.甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J].中国生物工程杂志，2006，26(7)：52-56)。目前，真菌来源的β-甘露聚糖酶基因，只有棘孢曲霉(Christgau S，et al..Expression cloning，purification and characterization of a beta-1，4-mannanase from Aspergillus aculeatus.Bioehem Mol Biol Int.1994，33(5)：917-925)和里氏木酶(黄生平，汪昌丽，马立新.一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达.生物技术通讯，2007，18(2)：220-223.)的基因序列在酿酒酵母中得到了表达，但酶活较低。总体上来说，目前所报道的β-甘露聚糖重组酶酶活普遍较低，酶解产物组成不稳定，生产成本较高。因此筛选高比活酶基因，构建高效产酶微生物，进行基因改良，优化酶的性质，是当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种产β-甘露聚糖酶的菌株，Aspergillus niger，其保藏号为：CGMCC No.4235。

本发明的再一目的是提供一种来源于上述菌株的酸性β-甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述酸性β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种高效表达β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的应用。

本发明从土壤环境中筛选到一种天然菌株，黑曲霉AN070902(Aspergillus niger)，该菌株于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4235。

从上述菌株中分离得到一种酸性β-甘露聚糖酶VMAN，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

MKFSSSLLAL DSLALANVST TLTKTSPAPS TSSSAASTSF PSTSGLQFTI

DGETGYFAGT     60

NSYWIGFLTD SADVDLVMGH LKSSGLKILR VWGFNDVTSQ PSSGTVWYQL