[发明专利]一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种终止转基因植物通过花粉将外源基因传递给其它植物的方法，从而有效降低了转基因植物的环境风险，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增加，转基因生物的大规模环境释放及其可能带来的环境生物安全问题已经日益成为目前全球最受关注和争议的领域之一。转基因植物中的外源基因通过基因漂移（或天然杂交）转移到环境中的非转基因品种或其野生近缘种（包括杂草种类）中，并通过遗传渐渗在野生近缘种的群体中存留或进一步扩散，从而带来环境生物安全问题。花粉介导的基因漂移广泛存在于具有杂交亲和性的植物种类之间，包括同一物种不同群体和不同物种之间的基因漂移。与其它形式的基因漂移（如种子介导的基因漂移）相比，花粉介导的基因漂移由于可以借助风力和昆虫进行，因而是最不容易避免的。

   目前已经发现一些降低花粉中外源基因扩散的方法，常见的如叶绿体转化、花粉中外源基因的去除等。

大多数植物的叶绿体是母性遗传的，如果外源基因整合到叶绿体基因组上，就不能通过花粉向其它植物扩散，因此可以避免外源基因的扩散。然而叶绿体转化只在少数植物中利用基因枪法获得了成功。另外，叶绿体转化载体包含有叶绿体同源片段，以保证外源基因的定点组合，而大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚，因此，无法确定用于载体构建的同源片段和外源基因插入位点，对未知序列叶绿体基因组只能通过保守序列来完成。另外一个关键的问题是，大多数植物细胞含有10-100个叶绿体，每个叶绿体又含有高达100个质体基因组拷贝，而只有少数的质体基因组能够转化成功，使外源基因完全整合到叶绿体每个DNA拷贝中需要有效的组织培养方法以及筛选技术，而对于大多数单子叶植物来说目前还没有建立起来有效的转化和筛选系统。

特异位点重组（如Cre/loxP系统、FLP/FRTs系统和锌指核酸酶（ZFNs）系统）是将花粉中外源基因剪切掉的方法。在这类体系中，花粉特异启动子驱动位点特异重组酶将其识别位点旁侧的转基因元件准确切除，而不影响花粉的正常生成和功能，但是这种方法的效率较低。最新发展的loxP/FRTs系统可以被Cre或FLP任何一种重组酶识别，相比Cre/loxP和FLP/FRTs，具有更高的效率（Luo, K. et al. ，2007），但是这一技术目前只在烟草中得到了验证。

雄性不育是另外一种广泛应用于商业化转基因植物中避免花粉介导转基因漂移的方法。Mariani等利用Barnases基因创造了烟草和油菜的雄性不育系，雄性不育株系做母本，野生型株系做父本，获得的杂交种借助Barstar基因恢复育性。然而，其负效应表现在，与对照相比，以花粉为食物的昆虫如油菜花露尾甲长成成虫的数量明显减少。 而且，有证据表明，barnase对动物和人类细胞具有毒性，因此需要植物特异表达barnase的部位不是被食用的部分。另外，Barnase在应用方面还存在着很多问题，例如：雄性不育性状具有温度敏感性，容易受环境影响而不稳定、即使在花粉特异启动子下，barnase的毒性也有可能会泄露表达在植物体其它部位，从而引起各种重要农艺性状的变化、barnase在后代分离中存在不稳定性等。因此，这种方法也不是理想的控制转基因漂移的方法。

发明内容

本发明提供了一种有效阻止转基因植物通过花粉传播至其它水稻品种、野生近缘种、野草以及其它植物的方法。此方法的核心技术是利用花粉形成后期特异启动子PG47驱动花粉致死基因ZM-AA1，将携带有转基因的花粉杀死，而不带转基因的花粉仍然能够正常发挥功能。

本发明的优点在于：1）带有转基因的花粉粒因为携带有一个植物来源的糖代谢基因而完全失活，效率高达100%，降低了由花粉介导的基因漂移造成的环境风险；2）花粉致死基因由花粉发育后期特异启动子驱动，对另外一半不携带转基因的花粉粒的形成和功能完全无影响；3）外源基因可以通过雌配子传递。

本发明通过以下方案来实现：首先构建转化载体，将花粉致死基因ZM-AA1置于花粉发育后期特异性启动子PG47下游，红色荧光蛋白FP基因置于愈伤组织和种皮特异性启动子END2下游，两个基因表达盒紧密连锁；然后利用野生型水稻品种中花11幼胚或成熟胚诱导的愈伤组织作为转化外植体，利用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入；受体细胞在共培养后的30天内利用荧光显微镜进行三次筛选，将稳定表达红色荧光的愈伤组织分化成幼苗；对转化幼苗进一步进行分子生物学鉴定和花粉活性鉴定。

本发明依次通过以下步骤来实现：