[发明专利]一种杂合酶P450sca2-BMR及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂合酶P450sca2-BMR及其编码基因与应用。

背景技术

随着冠心病成为当今社会的主要致命病症之一，研究高效的调血脂药物成为制药工业的一个重要的目标和责任。利用化学法羟基化美伐他汀生产普法他汀在经济上是不可行的，生物法简单易行逐渐发展成普法他汀的主要生产方法。普法他汀的生物法工业生产是两步发酵过程，首先由橘青霉(Penicillium citrinum)发酵生产美伐他汀，由浓碱处理为钠盐形式，再利用微生物转化的方法将美伐他汀钠羟基化生成普法他汀钠。

野生型细胞色素P450sca-2是含有410个氨基酸的蛋白，存在于澳大利亚土样中发现的嗜碳链霉菌Streptomyces Carbophilus中(Matsuoka T，Miyakoshi S.PureCytochrome P-450Enzyme are Obtained from Streptomyces Carbophilus and Used forHydroxylation especially ofMacrolide Antibiotics：Japan，US5179013A.1993-01-12.)。该菌株对美伐他汀具有强羟基化作用并且副产物很少，因而用于普法他汀的生物法工业生产，其中其主要催化作用的是细胞色素P450sca-2。生物法发酵美伐他汀生产普伐他汀的过程具有低效高成本等劣势，因此通过重组表达和改造细胞色素P450sca-2实现酶法生产普伐他汀具有重要的现实意义。

细胞色素P450sca-2催化美伐他汀羟基化生成普伐他汀的过程是典型的细胞色素P450催化小分子有机物单加氧反应的过程。野生型细胞色素P450sca-2催化体系属于双组分细胞色素P450催化体系，需要氧化还原辅酶的协助将来自NAD(P)H的电子传递到细胞色素P450的活性中心。不同于其他双组分细胞色素P450催化体系，细胞色素P450sca-2的催化体系不是结合在膜结合锚点上而是存在于细胞液中。电子在不同蛋白分子间的传递影响了体系的电子传递效率和利用率，也影响了细胞色素P450sca酶的催化活性。因此希望通过构建细胞色素P450sca-2杂合酶实现电子的自给自足，设计出满足酶法生产普伐他汀工业需求的蛋白。

细胞色素P450BM3是人们发现的第一个单组分体系细胞色素P450酶，最早由Fulco等在Bacillus megaterium中获取(Narhi L O，Fulco A J.Phenobarbital Induction of aSoluble Cytochrome P-450-dependent Fatty Acid Monooxygenase in Bacillus megaterium.The Journal ofBiological Chemistry.1982，257(5)：2147-2150.)。细胞色素P450BM3电子传递效率高于大部分其它细胞色素P450酶，其结构和空间折叠为酶体系提供了有效的自给自足的电子传递系统，可将NAD(P)H产生的电子100％用于产物生成，催化效率也远高于许多其它酶系统，为研究细胞色素P450单加氧催化体系的电子传递机制和进行杂合酶设计提供了良好的参照。

发明内容

本发明目的是提供一种具有羟基化美伐他汀的催化活性的蛋白。

本发明提供的蛋白，命名为P450sca2-BMR，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羟基化美伐他汀的催化活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中序列2所示的蛋白有1010个氨基酸残基，第1-410位为P450sca的酶功能域(HEME功能域)、第411-432位为连接肽、第433-1010位为P450BM3的天然氧化还原域。

蛋白P450sca2-BMR的具体示意图如图1所示。

为了使1)中的P450sca2-BMR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列