[发明专利]一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。

背景技术

延胡索酸(Fumaric acid)，又名富马酸(IUPAC名为反丁烯二酸)，是最简单的不饱和二羧酸。在工业、医药、食品及畜牧业中均有非常广泛的应用。2004年，美国联邦政府能源部专门成立了1,4-二羧酸组，主要研究延胡索酸和苹果酸及琥珀酸，而这三种有机酸包含在被称为最引人瞩目的可再生的十二大化工结构元件，同一年的世界经合组织(OCED)发展报告也将其列为着重发展的C4化合物。

石油化工路线(petrochemical routes)是当前延胡索酸的主要生产方法，但是随着石油价格的不断上涨以及石油资源的不可再生性，研究人员又把目光投向了微生物发酵法生产延胡索酸。目前研究得最多的微生物是米根霉(Rhizopus oryzae) 和少根根霉(Rhizopus arrhizus)。但是，R. oryzae和R. arrhizus表现出复杂的生长形态，在发酵过程中会形成菌丝、菌球和大块聚集物。其生长形态受多种因素的影响，如菌种本身的特性、营养供应情况、培养基的pH 值、搅拌通气、接种量和基质浓度等。菌丝和大块聚集物的形成会影响溶氧和传质，很大程度上会影响最终的结果。而且，R. oryzae是人、动物和植物的强致病菌；此外，由于它们的遗传信息和生化机制的研究较少，加上它产生分生孢子，对其直接进行代谢工程改造十分困难。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）作为一种真核模式微生物，其遗传信息较为清楚，便于代谢工程研究；S. cerevisiae作为一种单细胞微生物，其营养要求简单，特别适合工业化生产；S. cerevisiae被美国FDA认证为GRAS(General Regarded As Safe)。S. cerevisiae的以上诸多优势，使得其已成为代谢工程生产有机酸的良好宿主，但S. cerevisiae本身并不积累延胡索酸。而R. oryzae可以积累大量的延胡索酸，13C同位素示踪研究表明R. oryzae积累延胡索酸主要是通过胞质三羧酸还原途径，即是通过丙酮酸羧化生成草酰乙酸，然后转化为苹果酸，进一步转化为延胡索酸。本发明从通过将R. oryzae的关键基因转化到酿酒酵母中表达，构建一条延胡索酸积累途径。代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸目前国内外均未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种能积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌，在其胞质中构建一条类似于米根霉的延胡索酸积累途径。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

克隆米根霉(Rhizopus oryzae)延胡索酸积累途径中关键酶基因苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)于双向表达载体质粒pY26TEF/GPD，然后转化酿酒酵母（S. cerevisiae BMA64），通过改造代谢途径，得到可积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌发酵生产延胡索酸的方法。

将30℃、200 rpm下培养24 h的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30℃、200 rpm条件下培养60 h，因S. cerevisiae BMA64为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的Leu、Trp、Ade、His。

延胡索酸的测定方法：

高效液相（HPLC）检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐：磷酸二氢钾8.34 g，磷酸氢二钾 0.87 g，乙腈 5ml，加水定容到1000mL， 用磷酸调节pH至2.5。流速为1ml min-1，温度为35度，检测器选用Agilent 1200 DAD检测器，检测波长为210nm。

所用培养基：

SC培养基：Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 1.7g/L, (NH4)2SO4  5 g/L, Glucose 20g/L。按要求分别添加Leu 100 mg/L、Trp 20 mg/L、Ade 20 mg/L、His 20 mg/L、Ura 20 mg/L。

种子培养基：SC培养基，装液量为20ml/瓶。

发酵培养基：SC培养基，添加碳酸钙，5g/L，装液量为50ml/瓶。