[发明专利]一种抗菌蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及抗菌蛋白，具体涉及抗菌蛋白的氨基酸序列及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素人类抵御细菌感染类疾病的主要武器，在医学发展史上发挥着重要的作用。但随着抗生素长期使用及滥用，导致许多细菌耐药性增加，如临床上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单孢菌等。最近出现的“超级细菌”能够耐受几乎所有的抗生素，已有多起致死病例，引起了世界性恐慌。寻找无细菌耐药性、能够替代抗生素的药物迫在眉睫。

抗菌蛋白是生物体经免疫诱导产生的小蛋白，有抑杀细菌、真菌、原虫和肿瘤细胞等多种功能。由于抗菌蛋白主要通过破坏细胞膜机制杀死细胞，不易诱导产生耐药菌株，容易被降解，不在微生物体内富集，因此被认为是能够替代抗生素的首选药物。已有报道来自青蛙皮的抗菌蛋白能够对抗“超级细菌”，但对人体细胞也有潜在毒性。寻找高效、无药物抗性、对人体细胞无毒害的新型抗菌蛋白是目前研究的热点。

天然抗菌蛋白的含量很低，提取步骤复杂；化学合成法制备蛋白的成本很高，远不能满足应用需要；抗菌蛋白对细菌有杀伤作用，不宜在原核系统中直接表达。毕赤酵母真核表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，具有许多优点：(1)利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOXI)启动子，可严格控制外源基因的表达，在胞外和胞内都可表达外源基因；(2)毕赤酵母生长速度快，培养条件简单，适合高密度发酵，有利于提高目的蛋白产量；(3)毕赤酵母作为真核细胞生物，可进行翻译后的蛋白加工，使其表达的蛋白得到正确的折叠和修饰，避免活性损失。国内外已有抗菌蛋白在毕赤酵母中成功分泌表达的报道。只要设计出适合酵母表达的抗菌蛋白基因序列，就能通过毕赤酵母大规模生产目的蛋白，降低生产成本，为抗菌药物的生产提供大量原料。

发明内容

本发明的任务是提供一种抗菌蛋白，同时提供这种抗菌蛋白的制备方法和应用。

实现本发明的具体方案是：

本发明提供的这种抗菌蛋白具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明抗菌蛋白的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或依照遗传密码简并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了制备本发明抗菌蛋白的重组表达载体，该重组表达载体含有编码本发明抗菌蛋白的基因。进一步说，该重组表达载体是在表达载体的多克隆位点中插入了编码本发明抗菌蛋白的基因，在所插入的编码本发明抗菌蛋白的基因的5’端加入了酶切位点和甲硫氨酸密码子，在所插入的编码本发明抗菌蛋白的基因的3’端加入了终止密码子和酶切位点。制备该重组表达载体的表达载体可以是pPIC9K质粒。

表达本发明抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)DNA聚合酶进行延伸反应：反应条件为：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，94℃变性3min，72℃延伸10min，得到DNA产物；

(2)PCR(聚合酶链反应)扩增DNA片段：PCR反应条件为：上述步骤(1)中的DNA产物1μL，序列表中序列5所示的引物P2(10μmol/L)和序列表中序列6所示的引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，超纯水7μL，94℃变性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，得到扩增的DNA产物；

(3)用上述步骤(2)的DNA产物1μL，序列表中序列7所示的引物P3(10μmol/L)和序列表中序列8所示的引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，得到进一步扩增的DNA产物；

(4)用上述步骤(3)中的DNA产物1μL，序列表中序列9所示的引物P4(10μmol/L)和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本发明抗菌蛋白基因的DNA产物；

(5)上述步骤(4)中的DNA产物用EcoRI酶切，pPIC9K质粒用EcoRI酶切并用CIAP碱性磷酸酶去磷酸化，电泳并回收酶切后的DNA产物和pPIC9K，经T4DNA连接酶16℃连接4h，得到的混合溶液体系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒；