[发明专利]一种适合工业化生产的检测抗菌肽产品的灵敏精确直观的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽产品的检测方法。 

背景技术

近年来出现的抗菌肽是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除具有广谱抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤细胞作用。由于最初被发现的是其抗细菌功能，因而被命名为抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)。抗菌肽的广谱抗菌活性和多项免疫功能，使其不仅可以作为饲料添加剂饲喂动物预防疾病，作为注射用剂治疗各种感染疾病；同时作为生物体的天然绿色产物，还可以利用分子生物技术、基因工程手段将其基因导入模式生物或养殖品中表达。作为取代传统抗生素的新一代抗菌剂物质的首选，抗菌肽具有抗生素所不具备的诸多优点：广谱抗菌、参与免疫反应、不易产生耐药性、安全无残留、稳定性高、用途广泛。 

随着抗菌肽逐渐成为新型抗菌产品的开发热点，越来越多的公司推出抗菌肽类新产品，除了我们公司以外，还有北京中农颖泰生物技术有限公司开发的饲用天蚕素抗菌肽和上海金肽源生物技术有限公司开发的饲用抗菌肽等。在研发过程中检测抗菌肽活性通常采用传统的药敏试验方法，多用扩散法、稀释法，能够达到定性的目的。 

以纸片扩散法为例，该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。 

此外，另一种常用的药敏实验方法为稀释法，稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度(MIC)。 

这两种方法虽然能够达到基础的药敏试验目的，但是对于严格的质控来说，它们都不算灵敏精确直观的检测抗菌活性的方法。但是目前，在抗菌肽产品成品质量控制过程中，也就是对于其中抗菌活性物质的检测，大多数实验室报道是采用常规药敏实验方法中的扩散法，通过测量抑菌圈的大小判断抗菌肽产品抗菌活性的强弱，但是这种扩散法的实验结果易受到客观因素的影响，如：抑菌圈的圆正、抑菌圈边缘的清晰度、培养基的软硬薄厚等，而且操作较为繁琐，这就为企业经常性的日常工作——产品质检带来不便；此外，市面上抗菌肽产 品根据其市场定位，其活性物质含量实际上大部分达不到做出抑菌图的效果。 

所以目前，在工业化生产中，找到一种适合抗菌肽产品质检的快速、灵敏且简便的方法，是一个迫切需要解决的问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种可以检测抗菌肽产品抗菌活性的灵敏精确直观的方法，检测结果可以以精确数值表示，此数值可以直接反应出抗菌活性的大小，且依据此数值可以计算出抗菌肽的含量多少。以此方法解决现有检测方法的不足。 

本发明技术方案为： 

1.检测培养基的制备： 

如：配置2倍浓度的LB液体培养基(或据需要配置其它相应培养基)： 

胰化蛋白胨20g酵母提取物10g NaCl 20g 

摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min。 

2.测试菌的制备： 

取对相应抗菌肽敏感的菌种，于液体测试培养基中正常培养，制备浓度相当于3-4麦氏标准比浊管的菌悬液。 

3.抗菌肽产品溶液的制备： 

以产品研发小试生产中测得的产品中抗菌肽含量为参考，将一定量的抗菌肽产品(抗菌肽为水溶性)充分溶解于一定体积的灭菌水中，10000r/min 10min离心取上清液，得到一定浓度的抗菌肽水溶液，此抗菌肽产品溶液浓度务必高于抗菌肽最低抑菌浓度(MIC)的2倍。 

4.标准曲线的测定(相同的生产工艺，只做一次即可)：