[发明专利]绒山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列及其毛囊特异性表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码VEGF164蛋白的cDNA及其毛囊特异性表达载体，更具体地说涉及编码VEGF164蛋白质的cDNA的573bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列及将克隆到的VEGF164基因与毛囊特异性的KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成VEGF164毛囊特异性表达载体pCDsRed-KV。

背景技术

内蒙古白绒山羊是经过长期自然选育形成的优良地方性绒肉兼用型品种，所产羊绒具有径细绒长、综合品质优良的特点，但由于近年来草场退化，种群数量增加，舍饲比例加大，导致产绒量降低。通过转基因技术导入促进毛囊发育和绒毛生长的功能基因，培育高产绒量新品系是解决这一问题的有效手段。血管内皮生长因子是一种二聚体糖蛋白，具有促进毛囊发育和毛发生长的功能。克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(VEGF164)基因并构建毛囊特异性表达载体，稳定转染胎儿成纤维细胞，筛选得到转基因细胞克隆，将为通过核移植方法获得高产绒量转基因绒山羊新品种提供条件。

血管内皮生长因子是1979年Dvorak等首先在无血清的肿瘤细胞培养液及动物癌性腹水中发现，Senger等(1983)分析后确定是一种以二硫键结合的二聚体肝素亲合性糖蛋白并命名为血管渗透因子(vascular permeability factor，VPF)。Gospodarowicz和Ferrara等(1989)从牛的垂体滤泡细胞中分离得到类似物，命名为血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，后经分析发现二者是同一种细胞因子，具有特异作用于血管内皮细胞的特异性，在体外可诱导血管发生，并可增加血管壁的通透性，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进伤口愈合及在恶性肿瘤中过表达等。近年的研究发现VEGF可明显促进毛乳头细胞的增殖和迁移，转VEGF基因小鼠可以促进毛发生长。进一步的研究表明(Man等，2009)VEGF是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子，在人初级毛囊中有表达，在外分泌汗腺的囊泡基底膜中的表达量也非常丰富。VEGF与动物毛囊发育和毛发生长密切相关。

迄今，关于VEGF在大鼠和小鼠中已被证实可以促进毛发的生长，但与绒山羊相关的研究还未见报道。也未见有绒山羊VEGF基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

在各种情况下，有重要的原因研究和开发与绒山羊VEGF蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚绒山羊的VEGF基因和蛋白的功能，可以用在通过转基因克隆技术培育高产绒量绒山羊，提高绒毛产量等方面，得到的绒山羊VEGF164基因的核苷酸序列可以用于通过RT-PCR方法或杂交的方法检测VEGF164基因在绒山羊不同组织和不同发育阶段的表达特性。

发明内容

本发明的目的是通过已知的不同物种的VEGF基因的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克隆绒山羊VEGF164基因的cDNA片段。对该片段测序后提供编码绒山羊VEGF164蛋白的基因cDNA的573bp的核苷酸序列和由此序列推断的氨基酸序列；将克隆到的VEGF164基因与毛囊特异性的KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成VEGF164毛囊特异性表达载体pCDsRed-KV，稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞后获得了具有红色荧光蛋白和新霉素抗性双选择标记的转基因细胞克隆，可以作为转基因体细胞核供体用于细胞核移植，为利用克隆技术培育高产绒量绒山羊新品系提供了条件。

本发明的基因产品采用以下方式表述：

1、绒山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

2、由权利要求1中cDNA的核苷酸序列推断出的绒山羊VEGF164蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

3、构建的绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体pCDsRed-KV如图9所示。

本发明的基因产品的制备方法概述为：