[发明专利]抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)家族是催化蛋白质肽链上丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)残基以合成O-糖链的起始酶。迄今为止，在哺乳动物中该酶家族至少有18个成员被克隆表达鉴定。通过基因数据库比较分析提示该家族有24个潜在的成员组成。所有的ppGalNAc-Ts都能够结合底物UDP-GalNAc，但它们在蛋白质骨架上的催化位点又有所不同，正是这种不同使得该酶成员众多，并有着广泛的组织分布。近年来研究表明，ppGalNAc-T家族成员在多种人肿瘤细胞或组织中存在异常表达，例如在鳞状癌变组织中ppGalNAcT1表达异常下降而ppGalNAc-T2和ppGalNAc-T3表达升高；在结肠癌中发现了ppGalNAc-T1，ppGalNAc-T2，和ppGalNAc-T3表达的异常升高。其中ppGalNAc-T3的异常表达还在结肠癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌以及原发性肝胆管癌中均有报道；在乳腺癌及胃癌中发现ppGalNAc-T6异常表达；还有研究小组在人胃肠道肿瘤中检测到ppGalNAc-T12的表达也发生了异常改变；重要的是，这些存在于肿瘤中的异常表达情况可成为潜在的肿瘤诊断依据。

为了更方便快捷地检测ppGalNAc-T在肿瘤中的异常表达情况，制备ppGalNAc-T抗体显得尤为重要。ppGalNAc-T2作为的ppGalNAc-T酶家族的一个重要成员，是O-糖链起始合成关键酶。

现有技术中，国外研究小组制备ppGalNAc-T2单/多克隆抗体，且用于人肿瘤的检测研究有以下报道：1)如2000年，来自日本的Takuhiro Kohsaki等人制备了兔抗人ppGalNAc-T2多克隆抗体用于检测结肠癌细胞及组织，发现ppGalNAc-T2存在明显高表达(参考：J Gastroenterol 2000；35：840-848)；2)早在1999年，丹麦的Ulla Mandel研究小组就成功制备了鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体并命名为UH4(IgG1)，该研究小组还对该抗体作了较为细致深入的研究(参考Glycobiology，1999，9(1)：43-52)。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体有高特异性、高效价等优点，更适用于目标抗原的检测，上述技术方案中，丹麦Ulla Mandel小组的制备方案具有以下优点：1)采用昆虫细胞表达产物作为免疫原，比传统的原核蛋白抗原或新兴的DNA抗原相比，在制备单克隆抗体上更有优势；2)在筛选阳性克隆时，选用了三级筛选，分别是间接免疫酶联吸附试验ELISA、免疫荧光流式细胞分析法和免疫共沉淀法；这更有利于筛选出真正的阳性克隆。

但他们的方案中同时存在了不足：首先，他们选用了昆虫杆状病毒表达系统(Sf9细胞)制备免疫原，但存在的一些问题如杆状病毒的基因组学研究相对薄弱，有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等还不十分清楚，表达产物的纯化比较困难，多元表达等方面的技术还不够成熟等，均有待进一步解决；其次，所制备的抗体在ELISA和免疫沉淀中有着较好的表现，但在免疫印迹WesternBlot实验中的表现却不尽人意，这就限制了该抗体的使用，因为免疫印迹试验是现在最为通用可靠的可定量检测目的蛋白表达情况的一种手段。

基于以上分析，需要制备一种高特异性、高效价的鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体，使其能够用于间接免疫酶联吸附实验(ELISA)，免疫印迹(Western-blot)，免疫细胞荧光(Immunocytoflurescence)，免疫荧光流式细胞分析(Flowcytometer Analysis)，免疫组织化学(Immunohistochemistry)等多种研究手段，以实现ppGalNAc-T2表达的快速通量检测。

发明内容

本发明目的是提供一种人ppGalNAc-T2的单克隆抗体，利用该单克隆抗体通过免疫学方法检测人ppGalNAc-T2基因的蛋白表达水平；本发明的另一目的是提供能产生具有良好识别ppGalNAc-T2蛋白并能与其进行免疫学反应的单克隆抗体分泌型稳定杂交瘤细胞株，通过该细胞株大量生产均质的、稳定的、多用途的、可用于商业化的单克隆抗体。