[发明专利]TT1基因在植物遗传转化筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及TT1基因作为筛选标记基因在植物遗传转化中的应用。

背景技术

自1983年第一株转基因植物诞生以来，全球抗虫、抗病、抗除草剂和品质改良的棉花、水稻、大豆、玉米等转基因植物已达120多种，种植面积9000万公顷。转基因技术的发展能够将具有优良性状的目的基因导入生物基因组中，从而使得其遗传性状得到改良。

目前基因转移在技术上还存在着一些限制因素，其中之一就是转化过程中只有少数细胞能够吸收外源DNA并整合进基因组中，而大多数细胞仍是未转化的。因此，目的基因的引入常常需要筛选标记基因，从而赋予受体生物以特定的选择性标记，以便于识别和鉴定转基因生物。现在广泛用于选择的标记基因主要有2大类：一类是抗生素抗性基因，包括新霉素磷酸转移酶基因(npt)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、卡那霉素抗性基因(npt II)等；另一类是除草剂抗性基因，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(epsp)等。

然而，当获得一个真正的转基因植株后，筛选标记基因就失去其功能和意义，这些标记基因在转化后仍保留在生物体内，其继续表达的产物也会带来一些不良后果，具有许多潜在的危害：

第一安全性。筛选标记基因中抗生素抗性标记基因的安全问题，主要是指其抗性基因转移所导致的在环境中的传播。另外，转基因动、植物中的标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。对除草剂抗性基因的担忧主要是因为这类基因可能存在杂草化等生态学风险。尽管风险评估报告对一些筛选标记基因提供了安全保证，公众对安全的关心已经大大阻碍了转基因作物的商品化，而且对其他标记基因及其产物的风险评估是一个既昂贵又繁琐的过程。

第二影响转化细胞再生。当细胞被转化后，需要从非转化细胞中鉴别并分离出转化细胞。筛选标记基因同目的基因共同转化，然后将转化后的细胞培养在含有抗生素或除草剂的培养基上，转化细胞能够存活并生长，而非转化细胞不能生长而最终死亡。非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的运输，进而影响转化细胞的增殖及分化。

第三影响多重转化。通过基因转移技术将多个外源目的基因导入植物体内，已成为育种学家们的研究目标。标记基因的使用虽然有助于转化细胞的筛选，但影响多重转化。在细胞第一次转化中使用了某一特殊的标记基因，在随后的转化中就要使用不同的标记基因。

尽管转基因植物能给人类带来了巨大的利益，但目前仍有很多人担心转基因植物可能对生态环境构成威胁，转基因食品也可能对人类健康造成危害。为了寻找新的、安全的筛选标记代替抗生素基因、抗除草剂基因，以甘露糖(磷酸甘露糖异构酶基因pmi)、木糖(木糖异构酶基因xylA)为筛选剂的转化系统应运而生。其原理是因这些糖类不被一般植物细胞吸收而使非转基因细胞的生长受阻，使转基因细胞分离出来。虽然这些糖类对生物细胞无害且易于被微生物分解，避免了抗生素的副作用，但用于遗传转化时，不同植物所需筛选剂浓度差别很大，且pmi本身就存在于一些豆科植物中外，可用其筛选的植物范围较小，在绝大多数植物上的效果还有待验证。

因此，为了消除人们的这种担忧，如何利用安全、有效的筛选标记基因进行外源目的基因的筛选，已经成为近年来植物转基因研究中的一个热点，也是今后基因工程研究的重要方向之一，目前本领域需要提供新的有效方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为转基因植物的筛选提供一种新的有效选择。

本发明解决技术问题的方案是提供了TT1基因在植物遗传转化筛选中的应用。

其中，上述TT1基因具有如下核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

进一步的，上述(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

本发明还提供了一种植物遗传转化筛选方法。该方法包括以下步骤：

a、将TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含有所述TT1基因的重组载体；

b、将步骤a中的重组载体转入目标植物细胞中；

c、经使用逆境条件进行筛选获得转化细胞。

另一方面，该方法还可以包括以下步骤：