[发明专利]用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种叶片组织保存方法，具体是一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brailiensis)，大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，为热带地区产胶乔木，是一类重要的经济作物。从上世纪90年代开始，随着分子生物学的迅速发展，橡胶树的研究也逐渐进入分子水平。从分子水平上对橡胶树的遗传基础和基因资源进行研究，是橡胶树属种质资源开发利用、品种鉴定、辅助育种等工作的一种重要手段，而获取高质量的总DNA是开展分子生物学研究的基础。

目前提取橡胶树叶片基因组DNA的常规方法主要有CTAB法和SDS法，两种方法所提DNA浓度和纯度均能达到后续的酶切或PCR扩增等分子生物学实验的要求。CTAB法和SDS法所采用的原理都是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

在提取植物叶片DNA的研究中，常规方法多采用新鲜或冷冻的材料(植物叶片)。提取DNA的材料应当尽量保持新鲜，样品保存的好坏，将直接影响DNA的提取效果。在胶园采集新鲜材料(橡胶叶片)时最好都携带液氮罐、干冰箱、冰盒或冰桶，样品运回实验室后应及时提取DNA。但在实际工作中，有时由于远距离采样或试验上的安排无法对新鲜材料及时提取DNA，此时植物样品的保存成为决定其中的DNA的结构保持完整与否的一个关键步骤。

冷冻是保持组织成分最有效的方式之一，目前叶片组织的冷冻主要集中在超低温保存，-80℃冰箱保存的样品所提的总DNA的质量和数量都与新鲜叶片相当。但超低温冰箱因价格昂贵、净重大、噪音大、耗电量高、散热量高、工作室温要求16～32℃等缺点，携带不方便，成本高，未能达到节约日常开支的效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，其利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现长时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存。

本发明所采用的技术原理：利用Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；利用EDTA螯合Mg²⁺或Mn²⁺离子，抑制DNase活性；PVP是一种高分子合成树脂，可溶于水、乙醇及氯仿，工业上常用作澄清剂、稳定剂，能络合多酚类物质，防止多酚物质氧化成醌类物质，避免溶液变褐而具有抗氧化作用；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止橡胶树叶片中酚类物质的氧化，避免褐变，有助于酚的去除；葡萄糖增稠，使悬浮后的叶片组织不会快速沉积。

本发明所采用的技术方案：

一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，其步骤如下：

1、采样与处理：采集处于古铜期、变色期或淡绿期的橡胶树叶片，装入取样袋中后快速置于冰盒或冰桶中带回实验室，并将叶片放入预冷研钵中，采用液氮研磨，至叶片成粉末状；与液氮挥发的同时，加入储藏缓冲液到离心管中，然后将粉末状叶片组织转移到离心管中，混匀，待用。所述储藏缓冲液是将Tris-HCl、Na-EDTA、PVP、B-Me和葡萄糖加入到无菌水中配制而成，其中各组分的含量为：Tris-HCl 0.05～0.15M、Na-EDTA 5～15mM、PVP 2～4％(质量百分比)、B-Me 1～3％(V/V)、葡萄糖(Glucose)0.35～0.45M。

2、保存：将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物置于低温环境中进行保存。

所述低温环境是指装有冰块或冰袋的容器。将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物放置于配备冰块或冰袋的泡沫箱里，盖严箱子，用胶带密封，一周内，待测样品仍然保持绿色。

所述低温环境是指温度为-10～-35℃的冷冻环境。将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物放置于-10～-35℃的冷冻环境中保藏即可达到长期保存目的，样品随时可取用，具备-80℃保存或新鲜叶片同样的效果。

本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现长时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，具有工艺简单、成本低、效果好等特点。

附图说明

图1为分别用CTAB、SDS提取的橡胶基因组DNA电泳图谱。

图中：1为采用CTAB法，2为SDS法，3为DNA 10000marker。

图2为分别用CTAB法提取的DNA酶切效果图。