[发明专利]一种多活性肽的串联DNA、构建方法、表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说涉及构建一种多活性肽串联DNA，利用其表达载体制备所述多活性肽的方法，和所述的多活性肽的医学用途。

背景技术

生物活性肽是蛋白质中天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。

在治疗原发性高血压药物研究中，目前已从天然食物蛋白质中分离出了具有降血压功能的生物活性肽，此类活性肽则是通过抑制血浆和血管内皮细胞血管紧张素酶（Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE）的活性，达到降低血压的目的。因其降血压效果明显、安全无毒副作用，已成为活性肽研究的热点。现在已陆续从多种动植物原料及下脚料中，如蝮蛇蛇毒、沙丁鱼、乳酪、大豆豆粕、发酵豆奶、玉米渣胶、原蛋白（参见：黄家音. 等人，食品与发酵工业，32: 81-86（2006））等分离出了多种具有降血压功能的活性多肽。

目前从牛乳蛋白酶解产物中发现了多种具有降血压功能的多肽，其中研究比较多的是多肽CEI-12（Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Glu-Val-Phe-Gly-Lys）、多肽CEI-5（Phe-Phe-Val-Ala-

Pro）、多肽CEI-7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）、多肽CEI-β7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）等（参见：董开发．等人，中国食品学报，4:86-90（2004））具有良好的降血压效果。

由于牛乳蛋白酶解产物为多肽混合物，种类繁多，活性差异很大，真正具有高活性的多肽的产率并不很高，对此分离纯化是活性富集的重要操作，但实践证明要达到对高活性多肽有效的分离纯化非常困难，成本大幅度增高。因此酶解产物很难成为制备高活性降血压药物的原料，限制了该产业的深入发展。

生物工程技术的快速发展为克服上述问题，实现活性肽的高效制备提供了可能。利用工程菌高效表达单一活性肽在抗菌肽、肿瘤抑制肽等的应用（参见：胡学军．等人，中国生物化学与分子生物学报，18（3）: 287-292（2002）；马洪星．等人，国际遗传学杂志，30: 169-172（2007）。），已经取得了成功。在对乳源性降血压肽CEI-12研究中，有研究者使用较大的融合蛋白（分子量为29 kDa左右）融合表达未串联的12个氨基酸CEI-12序列（分子量为1.3 kDa左右），表达效率极低（参见：Lv，G.S．等人，J．Dairy Sci．，86:1927-1931（2003）），同时因为牛乳蛋白酶解产物为多肽混合物，包含了多种高活性多肽成分，仅仅利用工程菌表达其中单一活性肽可能达不到很好的降血压效果。因此研究构建利用较小的融合蛋白标签融合表达两种或两种以上串联降血压肽基因，以期提高降血压肽表达效率和降血压活性，就显得很有必要。目前利用工程菌表达乳源性降血压活性肽的研究很少，利用工程菌同时表达两种或两种以上的降血压肽的研究更未见报道。

发明内容

本发明以两种乳源性降血压肽的制备为例，说明多活性肽的交替串联DNA的构建与表达。

本发明的第一方面提供了编码两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7的串联DNA，该基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面提供了构建上述两种降血压肽串联DNA的方法，该方法将编码降血压肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串联3次，该核苷酸序列对应的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7两个多肽片段。

本发明的第三方面提供了含有上述两种降血压肽串联DNA的表达载体pET30a-CEI-12,7。

本发明的优点是：利用pET-30a上较小的His标签片断融合表达交替串联3次CEI-12和CEI-7多肽，增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表达效率和减小了小肽的分离难度。

附图说明

图1显示了大肠杆菌BL21-MF3A3菌落PCR电泳图，说明该工程菌的质粒插入了大小为120bp左右目的基因；其中注：1、pET-30a⁺目的基因，2、pET-30a空载体，3、Marker；