[发明专利]一种洋葱愈伤组织诱导方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，涉及一种洋葱愈伤组织诱导方法及其专用培养基。

背景技术

洋葱属于百合科(Liliaceae)葱属，是世界范围内普遍栽培的重要蔬菜之一，它以肉质鳞片和鳞芽构成产品器官，营养含量丰富，是重要的营养保健型蔬菜。近年来，我国洋葱栽培面积迅速扩大，洋葱及其加工制品已出口至欧美、日本及东南亚许多国家。但是目前我国洋葱生产上使用的品种大多为国外品种，国内洋葱品种较少，造成这一情况的原因是洋葱为二年生草本植物，花器结构小，自交后易发生退化，育种上存在育种周期长，育种率低等问题。然而利用组织培养技术，可以提高育种效率。

洋葱组织培养所用起始材料种类很多，茎尖、鳞茎盘、叶片、鳞片、花器官等取材。Fridberg曾用附加NAA和KT的MS培养基从洋葱鳞片直接诱异成芽。姜璐琰等(2003)用洋葱花蕾作为外植体，经过愈伤组织及体细胞胚途径，获得了较高频率的再生植株，其愈伤最高诱导率为68.71％。

自1983年第一个转基因植物问世以来，植物基因工程技术的发展突飞猛进。烟草、番茄、辣椒等作物转基因方面已有大量的文献报道，一些转基因作物已在生产上应用。洋葱转基因体系已有报道，Eady等(1998)以未成熟胚为外植体，建立了高频的再生体系，最高诱导频率为60％，并建立了以根癌农杆菌为介导，以gfp和npt II为标记基因的转化体系，获得了转基因再生植株。但目前仍未见实际应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种洋葱愈伤组织诱导方法，本发明的另一目的是提供该方法专用培养基。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种洋葱愈伤组织诱导方法，包括选取洋葱外植体，采用添加2，4-D、6-BA的B5培养基进行愈伤组织的诱导培养；所述的B5培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5.8，添加的2，4-D浓度为0.5～2.0mg/L，6-BA浓度为1.0～4.0mg/L。

其中，所述的外植体选自洋葱幼嫩花序或者洋葱总苞被未开裂的花序中的幼蕾。

所述的外植体优选洋葱直径约0.8-1.2cm的幼嫩花序。

所述的外植体优选洋葱总苞被未开裂的直径为1.5-2.0cm的花序中的幼蕾。

选择所述的洋葱总苞被未开裂的直径为1.5-2.0cm的花序中的幼蕾作为外植体时，培养基的组成为：所述的B5培养基+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA。

该诱导方法还包括培养前处理：先将花序消毒灭菌，然后撕去总苞被，分别取外植体，消毒灭菌。

所述的消毒灭菌方法为首先用自来水冲洗0.5h，流水冲洗，再用70％的酒精消毒1min，然后用0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水漂洗3～5次。

所述的培养条件为温度为25±1℃，光照时间为16h.d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1。

以蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5.8的B5培养基为基础培养基，添加0.5～2.0mg/L 2，4-D，1.0～4.0mg/L 6-BA。

所述的培养基组成为以蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5.8的B5培养基为基础培养基，添加1.0mg/L 2，4-D及1.0mg/L 6-BA。

有益效果：

本发明利用不同生长时期的洋葱花蕾为外植体，对影响愈伤组织发生的因素进行研究，从而建立了一种洋葱愈伤组织诱导方法，利用该方法诱导洋葱愈伤组织，外植体的愈伤诱导率最高可达为100％。本发明通过外植体的选择、培养基的优化，提供了一种专用于洋葱愈伤组织诱导的外植体和培养基，该组合能显著提高愈伤组织的诱导率。本发明诱导方法提高了洋葱幼蕾愈伤组织的诱导率，为外源基因的转化和多倍体离体诱导奠定了基础。

本发明所选取的外植体具有消毒灭菌方法简单方便，接种后污染率低；愈伤组织诱导率高的优点。

附图说明

图1、外植体A培养8周后愈伤组织诱导图片。

图2、外植体B、C接种时幼蕾图片。

图3、外植体B培养8周时愈伤组织诱导图片，右上角为放大图。

图4、外植体C培养8周时愈伤组织诱导图片，右上角为放大图。

具体实施方式

实施例1

1.1无菌材料的获得