[发明专利]一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶(serineproteases)是一类蛋白水解酶，在蛇毒蛋白酶中占据着独特的位置，特别是蛙亚科和蝮亚科。其活性中心有His(Arg)-Asp-Ser三联体残基结构，因而得名。其活性可被丝氨酸修饰剂苯甲基磺酰氟(PMSF)或者二异丙基氟磷酸(DFP)抑制。另外，其氨基酸质序列与胰蛋白酶、激肽释放酶有较大同源性，均具有一个共同活性中心和相同的酶催化机制。蛇毒丝氨酸蛋白酶具有高度的序列相似性(6％-75％)，相同的活性中心构造和酶催化机制，但底物专一性却具较大的分化，这是由于活性中心外可变区序列的差异造成的，因而进一步体现为生物学和药理学功能的差异。根据其所具有的活性，蛇毒丝氨酸蛋白酶大致可以分为三类。第一类为类凝血酶：具有催化血纤蛋白原降解为血纤蛋白的活性；第二类是类激肽释放酶：有几种蛇毒丝氨酸蛋白酶具有裂解激肽原释放舒缓激肽的活性，其功能相当于哺乳动物的激肽释放酶或激肽原酶，因此被称为“类激肽释放酶”；第三类是有独特活性的蛇毒丝氨酸蛋白酶：包括激活C蛋白、血小板、凝血因子V以及纤溶酶原等。

综合以上这些特性使丝氨酸蛋白成为蛋白酶结构与功能研究的优良模型，并在临床医学诊断及心血管疾病治疗中得到广泛应用，丝氨酸蛋白不仅具广阔的药物开发前景，更是药理研究的优良工具。由于许多蛇毒丝氨酸蛋白酶的功能与凝血、溶血栓相关，有可能开发出治疗脑血栓和各种心血管疾病的药物，因此有关蛇毒丝氨酸蛋白酶研究也是国内外目前研究的热点领域之一。至今有相当一部分蛇毒丝氨酸蛋白酶已获得一级结构序列。随着分子生物学技术的发展，越来越多的蛇毒丝氨酸蛋白酶的基因得到了分离、鉴定和表达，并且一些已经达到了商品化。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛇毒中的丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用。

本发明从江浙蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中获得一种丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。全长233aa，理论分子量为25.495KD。实验表明该蛋白酶具有较高的精氨酸酯酶活性，具有抗血液凝结的活性。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，例如在非活性位点，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到由该蛋白衍生的蛋白。这些衍生的蛋白也属于本发明的范围。

本发明还包括编码前述丝氨酸蛋白酶的基因。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。此外，应当理解，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有较高同源性的核苷酸序列也能编码具有与上述丝氨酸蛋白酶具有同等活性的蛋白。例如，同源性在80％以上的核苷酸序列。因此，本发明基因还包括与SEQ ID No.1所示核苷酸序列同源性在80％以上的编码具有上述丝氨酸蛋白酶活性的核苷酸序列。

具体地，本发明的目的可采用以下技术措施进一步实现：

1、江浙蝮蛇中丝氨酸蛋白酶的分离纯化

取江浙蝮蛇蛇毒冻干粉(来源于辽宁省清源县)，用Tris-HCl缓冲液溶解，离心取上清透析后，过DEAE-Sepharose阴离子交换柱，得到活性洗脱液；取少量的活性洗脱液制作免疫亲和层析柱，将经过阴离子交换层析后的活性组分通过该亲和柱，即亲和色谱法纯化，得到的活性组分，进一步经过高效液相色谱HPLC检测，最终得到高纯度的丝氨酸蛋白酶。

2、总RNA提取

切下江浙蝮蛇的蛇头，立即取出毒腺，与液氮中速冻，置于-70℃备用，采用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(参阅Chomczynski P.等，Analytical Biochemistry.1987，162：156)抽提毒腺总RNA。

3、引物设计、合成的方法