[发明专利]一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗稳定剂技术领域，特别是涉及一种一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法，利用基因工程技术改造酵母菌生产类人胶原蛋白。 

背景技术

胶原蛋白又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，这类蛋白是人体内含量最多的蛋白质。胶原蛋白的氨基酸组成有如下特征：①、甘氨酸(glycine)约25～30％，每隔两个其他氨基酸残基(X，Y)即有一个甘氨酸，其肽链可用(甘-X-Y)n表示。②、胶原中脯氨酸(Proline)约12％，羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)约10％，一般动物性蛋白质中羟脯氨酸含量极少，另外丙氨酸(alanine)有11％，羟赖氨酸(hydroxylysine)约0.5％。③、胶原中缺乏色氨酸，所以它在营养上为不完全蛋白质。 

由于胶原蛋白具有非抗原性、可生物降解、易吸收、无毒和生物相容等特性，因此在医学材料领域备受青睐，被广泛用于手术缝合线、止血海绵、人工皮肤、人工血管、人工角膜、药物载体，疫苗稳定剂等方面。 

很多疫苗对制备和保存过程的条件非常敏感，尤其是减毒活疫苗。为了保护生物成分的完整性，在疫苗制备过程中通常加入稳定剂以确保免疫接种功效。一直以来，能够作为疫苗稳定剂的物质包括糖，碱金属磷酸盐，谷氨酸盐，牛或人血清白蛋白，酪蛋白水解物等，最主要的还有明胶。明胶(Gelatin)是胶原的水解产物，是一种无脂肪的高蛋白，不含胆固醇，是保护疫苗稳定的优良选择，但其主要从动物皮提取获得。 

由于动物来源的胶原蛋白存在病毒隐患和易引发人体排异反应，因此采用分子生物学技术制备重组人胶原蛋白有着各种传统提取方法不可比拟的优势。目前，国内外报道的利用基因工程技术表达胶原蛋白的宿主有，微生物(大肠杆菌和酵母)，昆虫，哺乳动物细胞等。由于大肠杆菌易培养，繁殖快，已有很多转基因药物成功表达的实例，现已成为人们首选基因表达的载体。然而对于类人胶原蛋白来说，大肠杆菌存在致命的缺陷，即大肠杆菌表达系统无法进行蛋白翻译后修饰，所以无法形成高级结构的胶原蛋白。昆虫和哺乳动物细胞目前均处在实验室水平，虽然两者表达的重组胶原蛋白在结构功能上更接近于人体胶原蛋白，但其成本高，生产周期较长等缺陷均又阻碍了它们的发展。酵母是真核生物，具备分子伴侣蛋白和糖基化、羟基化、乙酰基化的酶，可以对一些具有高级结构的蛋白在合成后进行一定的修饰，并且酵母细胞的培养条件，成本也较哺乳动物细胞低得多，非常适合工业化生产。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法，一 株新的酵母工程菌株，其可以利用人工合成类人胶原蛋白基因表达小分子量的类人胶原蛋白。 

该酵母工程菌命名为毕赤酵母(Pichia sP.)，编号CGMCC No.4187。该菌种已经在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4187，保藏时间：2010年9月20日。 

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为： 

1.一种人工合成类人胶原蛋白基因col，其碱基序列如下 

GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCGGACCCGATGGTAAGACTGGACC 

CCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCAGGGGCCCGAGGCCAAGCAGGTGTTA 

TGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAAAGCCGGCGAAAGGGGTGTCCCAGGACCACCA 

GGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGGTGCTCAGGGTCCACCAGGACCTGCTGGTCCTGCTGG 

AGAAAGATAA 

其核酸长度为306bp。 

2.所述类人胶原蛋白的生产方法如下： 

(1)所述酵母工程菌的构建方法 

①根据已知胶原蛋白氨基酸序列人工合成其基因序列，然后进行酵母密码子偏好性的修饰，最终获得人工合成类人胶原蛋白基因col。 

②再将人工合成类人胶原蛋白基因col克隆至酵母表达载体pPICZα，命名为pPICZα/col；。 

③利用电击转化方法将重组质粒pPICZα/col转化至酵母细胞X-33。