[发明专利]一种干扰素融合蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组人免疫球蛋白可结晶片段 （crystalizable fragment，Fc）融合干扰素的制备，用这种方法制备的干扰素能明显延长干扰素在体内的作用时间，可用于人类相关疾病的治疗。

背景技术

抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应功能，包括决定抗体半衰期和在体内的分布固定补体和结合细胞表面Fc受体的能力。Fc结构域的性质使其称为有用的治疗剂。许多研究已将Fc 结构域融合于其他非抗体蛋白质，例如受体蛋白，例如伊纳西普，也可将Fc结构域融合体用做研究试剂，Fc标签其有利于蛋白的检测与纯化。

人IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体, 它在人体内的半衰期约为20天, 其稳定性是由于IgG 的Fc片段可与新生Fc受体(FcRn)结合, 避免IgG进入溶酶体中被降解。因此, IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白, 以提高活性蛋白的体内半衰期, 达到长效的目的。IgG可通过Fc片段上的补体结合位点激活补体, 起到细胞杀伤作用。根据铰链区的长短及 Fc片段氨基酸序列的不同, 人IgG分为4个亚型（γ1、γ2、γ3和γ4）, 其中IgG Fcγ2具有较低的诱导细胞毒性作用, 而IgG Fcγ1最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc (Hinge-CH2- CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连, 以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。另外, 如果活性蛋白以同源二聚体的形式发挥其生物活性, Fcγ片段及铰链区的半光氨酸构成的分子间二硫键可增强和稳定融合蛋白二聚体的形成。例如人白细胞功能抗原3 (LFA-3), 肿瘤坏死因子受体II(TNFRII), 白细胞介素12(IL-12)等, 这些融合蛋白在保留细胞因子生物功能的同时在动物实验中明显延长细胞因子的半衰期。此外, IgG的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段, 但是由于其高效性、半衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。

干扰素（IFN）是一种多功能细胞因子，其首先被发现的生物活性是抵制抗性病毒感染。多年以来，干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，发现干扰素有许多其它生物功能，如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。干扰素有两个完全不同的家族，分为I型和II型。I型干扰素主要包括IFNα和IFNβ，II型干扰素为IFNγ。I型干扰素的主要作用是抗病毒，IFNα和IFNβ两者共同用一种受体，但具有完全不同的免疫原性。IFNα主要由人白细胞产生，称为白细胞干扰素，IFNβ主要由成纤维细胞产生，称为成纤维细胞干扰素。IFNα有很多亚型，如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3等约有20种亚型，此外还有亚亚型，如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b等，IFNα有几十种之多。IFNβ尚未发现有亚型。II型干扰素主要由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子，又称免疫干扰素。IFNγ只有一种活性形式的蛋白质，没有其它的亚型。干扰素是具有广泛生物学活性的调节蛋白质，具有抗病毒、免疫调节的作用，对多种肿瘤细胞具有辅助性杀灭或抑制增殖作用，还能抑制癌基因表达从而阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞转化的过程。自80年代开始研制出重组人干扰素以来，目前有60多个国家批准上市。广泛用于乙肝、丙肝；白血病；疱疹、湿疣；肾癌、膀胱癌；淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤等多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。

但普通干扰素存在某些不够理想之处，由于干扰素分子量小，易被肾小球滤过，所以皮下注射后吸收很快，半衰期短，容易被酶水解等，一般要每天注射或至少每周注射三次，应用不够方便。而干扰素治疗肝炎、肿瘤、类风湿及多发性硬化症等疾病时，治疗周期常常长达数月甚至数年，这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用而且易产生发烧、疲乏、食欲减退及流感样症状等毒副作用。