[发明专利]针刺幼苗茎节法高效诱导紫草毛状根的产生及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种采用发根农杆菌侵染紫草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物（如紫草宁及其衍生物等）。

背景技术

紫草属于紫草科多年生草本植物，是名贵中药材，以根入药。紫草在我国分布广泛，主要分布于新疆、西藏、内蒙、云南、贵州、四川、黑龙江、吉林、辽宁、河北、湖南等地。紫草具有凉血，活血，清热，解毒的功效；用于清热凉血，透疹解毒，麻疹透发不畅，温热斑疹，紫癜，吐血衄血，湿热黄疸；外用皮肤湿疹，疮毒痈肿、溃疡、小儿尿布皮炎等症（Papageorgiou et al., Angew Chem. Int. Ed., 1999, 38: 270-300; Yoon et al., Plant Med., 1999, 65: 532-535）。另外，近年来，从紫草中提取出的紫草素、紫草油、亚麻酸等已应用于化妆品、食品添加剂、保健用品、酒类及抗癌药品等，国内外市场需求量很大，因此发展紫草种植与开发的社会及经济效益均极其显著 （石书河 等，中国油脂, 2000, 25: 47-48）。然而天然紫草资源有限，生长周期长达几年；此外，野生的植物大量被采挖，资源日趋枯竭。目前，当地政府已严禁采挖。

随着科学的发展，采用愈伤组织细胞及悬浮细胞生产药用植物天然活性成分已成为一种优良的替代生产体系。植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在，已经取得了令人瞩目的成就。紫草也是世界上第一个采用细胞培养体系来商业化生产紫草药用次生代谢产物的药用植物（Tabata and Fujita, Biotechnol. Plant Sci., Zaitlin et al.,（Eds.）, Academic Press. Orlando, 1985, 207-218），然而在植物细胞培养过程中普遍存在细胞系不稳定，细胞生长缓慢，不耐剪切及代谢物产量低等问题成为其实现规模化生产的瓶颈（Hamill et al., Bio. Technol., 1987, 5: 800-804）。

毛状根体系的建立已成为另一个具有广泛应用前景的高效生产药用次生代谢产物的生物技术体系，是由发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染植物后形成的一种外形如根系的转基因体系。发根农杆菌是属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，能侵染绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物及个别裸子植物，诱发植物被侵染受伤部位产生毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根特性是由于它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒（root-inducing plasmid）。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个大质粒，带有冠瘿碱等合成基因和生长素合成基因（Chilton et al., Nature, 1982, 295: 432-434）。诱导产生的毛状根具有很多的优点：①毛状根培养不需要加外源激素的情况下即可生长迅速且分枝多；②毛状根培养次生代谢物含量一般远高于细胞悬浮培养且含量稳定；③遗传性状稳定；                                                利用毛状根进行生物转化研究可产生某些新奇的化合物，为制药提供新的试材。自1977年Ackermann首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有160多种植物诱导出了毛状根，40多种植物建立了毛状根培养系统，并且利用其进行药用次生代谢产物的生产（陈永芳 等，西北植物学报，2008，28:2423-2428）。由于重要药用有效成分大多在根部，而Ri质粒诱导产生的毛状根具有根的特性，且具有生长速度快、激素自养、分化程度高，以及遗传性状相对稳定等优点，因此，毛状根较细胞培养更有利于药用次生代谢物的大量生产。

随着生物工程技术的不断提高，利用农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养快速大量高效生产有效成分，已成为药用植物资源可持续发展的有效途径之一。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种用发根农杆菌侵染紫草幼苗茎节处，快速、高效、稳定诱导紫草毛状根产生的方法，并对获得的紫草毛状根选用适宜的培养基，大量繁殖并应用于生产药用次生代谢产物（如紫草宁及其衍生物等）。

（1）本发明的技术方案为：