[发明专利]表达轮状病毒类表达颗粒的毕赤酵母、其制备方法及用途

说明书

发明领域

本发明涉及遗传工程领域，特别是，利用酵母系统表达轮状病毒结构蛋白，组装轮状病毒类病毒颗粒，用于预防轮状病毒感染。 

发明背景 

轮状病毒是全球婴幼儿严重腹泻病最常见的病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪—口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。 

轮状病毒总共有七种，分别以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G等。人类主要是受到轮状病毒A种、B种与C种的感染，而其中最常见的是轮状病毒A种的感染。而这七种轮状病毒都会在其他动物身上造成疾病。 

在轮状病毒A种之中有不同的病毒株，称之为血清变异株(serovar)。与流行性感冒病毒类似，轮状病毒使用了双重的分类系统，依据病毒体表面的两个结构性蛋白质来作分类的。糖蛋白VP7定义了G型。而对于蛋白酶敏感的蛋白质VP4则定义了P型。P型会以一个数字来标示出P血清型，并用方括弧内部的一个数字来标示所对应的P基因型。G血清型的表示方法也很类似，但是G基因型的数字会与G血清型的数字相同。举个例来说，“轮状病毒Wa病毒株”(rotavirus strain Wa)就会被标示成“P1A[8]G1”。因为这两个决定G型跟P型的基因可以被分开传送而产生后代，所以两基因不同的组合就会产生各种不同的病毒株。 

轮状病毒的基因组包括了11条独特的核糖核酸双螺旋分子，这11条中总共有18,555个核苷碱基对。每一条螺旋或是分段即是一个基因，并且依照分子尺寸由大到小依次编号为1到11。每一个基因都可以编码成一种蛋白质，而其中第9基因与第11基因比较特别，它们都可以编码成两种蛋白质。核糖核酸外围则是包围了三层二十面体的蛋白质衣壳。病毒颗粒大约直径76.5nm，并且没有病毒包膜。有六个病毒蛋白架构了整个病毒颗粒(病毒体)。这些结构蛋白分别被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7。除了这些结构蛋白之外，还有六个非结构性蛋白(nonstructural protein，NSP)，这六个蛋白仅仅在轮状病毒感染的细胞中制造，而没有构成病毒体的结构。这六个非结构性蛋白分别称为NSP1、NSP2、NSP3、 NSP4、NSP5与NSP6。 

由轮状病毒基因组所编码的12个蛋白质中，至少6个会与核糖核酸结合。这些蛋白在轮状病毒复制时所扮演的角色目前还没有完全被了解；它们的功用被认为有可能是与病毒体内核糖核酸的合成与包装相关，或是与将信使核糖核酸输送至基因体复制现场相关，或是与信使核糖核酸转译与基因调节相关。 

结构性蛋白： 

VP1蛋白位于病毒体核心，是一种核糖核酸聚合酶。在被感染的细胞中，这种酶会产生病毒蛋白质合成所需的信使核糖核酸转录复本，以及产生轮状病毒基因体核糖核酸片段拷贝来提供新产生的病毒体使用。 

VP2蛋白形成病毒体的核心层，并且结合核糖核酸基因体。 

VP3蛋白是病毒体内核的一部分，而且是一种称为鸟苷酸转移酶(guanylyl transferase)的酶。这种酶是一种加帽酶(Capping enzyme)，也就是制作信使核糖核酸转录后修饰时候所用的5′端帽的酶。这个5′端帽保护病毒的信使核糖核酸免受核酸酶(以核酸为底物的水解酶)水解，使之能够保持稳定。 

VP4蛋白位于病毒体的表面，突出来而成为一个刺突(spike)。它与细胞表面受体结合，与病毒粘附细胞有关。在病毒有传染性之前，VP4蛋白会被一种可以在内脏发现的蛋白酶改变成VP5*蛋白与VP8*蛋白。VP4蛋白决定了该病毒的毒性(Virulence)，而它也决定了该病毒的P血清型。 

VP6蛋白形成壳体。它是抗原性强的蛋白质，并且可以被用来分辨轮状病毒的种类。这个蛋白质被实验室用来进行轮状病毒A种感染的检测试验中。 

VP7蛋白是一种构成病毒体外层衣壳的糖蛋白。除了在病毒结构上的功用之外，它也决定该病毒株的G血清型。VP7蛋白质跟VP4蛋白质一样，都是免疫的主要靶标，是防止感染的主要途径。 

轮状病毒毒株在各地有很大差异，但人类的轮状病毒疾病主要是由5种血清型引起的，其中中国以G1P8和G3P8血清型为主。现在上市的轮状病毒疫苗主要以人-动物重配株和动物减毒株活疫苗为主，这类疫苗应用可以导致肠套叠等严重副反应的发生。由轮状病毒不同血清型产生的感染，疫苗的交叉保护性可能较弱，以及目前疫苗可能产生的严重副反应，强烈需要新的轮状病毒疫苗来满足治疗和预防的需要。