[发明专利]一种产脂肪酶工程菌及其制备脂肪酶催化剂和脂肪酸甲酯的方法

权利要求书

1.一种产脂肪酶基因的工程菌，分类命名为大肠杆菌BL21，菌株名为GXAS-lipSE，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉市武汉大学，保藏日期为2010年6月22日，保藏编号为CCTCC M 2010152。

2.一种构建CCTCC M 2010152的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(a)脂肪酶表达质粒的构建；

(b)获得产脂肪酶的重组大肠杆菌；

(c)发酵重组大肠杆菌生产脂肪酶并检测；

其中：

步骤(a)所述脂肪酶表达重组质粒的构建方法是将来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的脂肪酶合成基因lipA克隆至环境诱导型表达质粒pET22b中，获得脂肪酶表达重组质粒pET-lipA；脂肪酶表达质粒合成基因lipA是利用PCR技术扩增得到，所用的引物是：

LIPA1：ACTCCATGGGCATCTTTAGCTATAAGGATCTG；

LIPA2：CATAAGCTTTTAGGCCAACACCACCTGATCGGT；

步骤(b)所述重组大肠杆菌的构建方法是将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，获得产脂肪酶的重组大肠杆菌；

步骤(c)所述重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为30-40℃，摇床转速设为150-300转/分，发酵时间12-24h；发酵优选条件为：温度设为37℃，摇床转速设为250转/分，发酵时间是16-18h；发酵培养基的组成为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、5g/L CaCl₂，调pH值7.0，发酵过程中按千分之一的体积比例加入50g/L的氨苄青霉素，待发酵液OD600为0.6时加诱导剂乳糖至终浓度为1％或IPTG至终浓度1mM。

3.一种利用CCTCC M 2010152制备固定化脂肪酶催化剂的方法，其特征在于步骤为：将灭过菌的LB培养基置于发酵罐中，接入工程菌株CCTCC M 2010152，然后按千分之一的体积比例加入氨基酸苄青霉素(AMP)和0.1MCaCl₂，待发酵液OD600为0.6左右按1％的质量体积比加入诱导剂乳糖或IPTG至终浓度为1mM，继续诱导培养16-18h，离心收集菌体后用TrisHCl缓冲液重悬菌体，再加溶菌酶破胞2h，离心取上清制备粗酶；制备的粗酶液采用大孔吸附树脂吸附，残余的酶液用sol-gel包埋法进行酶的固定化，收集全部固定化的酶，即制得可供进行脂交换反应的酶催化剂。

4.一种利用权利要求3所述固定化脂肪酶催化剂制备脂肪酸甲酯的方法，其特征在于步骤为：将固定化脂肪酶催化剂填入固定床反应器中，并设定恒温在40-55℃之间，在原料贮罐中将原料油与甲醇按1∶3～1∶5的摩尔比充分搅拌混合成乳状，并控制反应液中的水分含量为油质量的4％-8％，将原料导入填充床中，控制反应液的流量使反应液在床层中的停留时间在60～600分钟。