[发明专利]抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及到一种抗人NKp30单克隆抗体，具体地说，针对NKp30第19至130位氨基酸中序列有反应性的单克隆抗体。本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还涉及单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。本发明还涉及单克隆抗体的应用及其试剂盒。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)作为主要的天然免疫细胞，在机体杀伤病毒感染细胞以及肿瘤细胞方面起着重要的作用，NK细胞通过其表面不同的活化型受体和抑制型受体来控制NK细胞的活化、增殖和杀伤等功能。NK细胞发挥其细胞毒作用是由NK细胞表面的活化型受体介导的，在这些受体中，有一类直接参与自然细胞毒作用的活化型受体，称为自然细胞毒受体(natural cytotoxicity receptors，NCRs)，它们相对特异地表达在NK细胞表面。NKp30属于NCR家族受体，也被称为NCR3，在静息或活化的NK细胞表面均有表达。NKp30在介导NK细胞杀伤中发挥着重要的作用，另外，NKp30能够介导NK细胞与树突状细胞(DC)之间的交互调节(cross-talk)，从而实现对天然免疫和获得性免疫的调节。

人NKp30是具有190个氨基酸的I型跨膜蛋白，胞外含有一个19个氨基酸组成的信号肽，成熟的多肽为171个氨基酸序列。成熟的NKp30胞外段含有一个IgV结构域，作为识别配体的功能区域，胞外区有两个糖基化位点。跨膜区由19个氨基酸组成，包含一个带正电的精氨酸，胞内区由33个氨基酸组成，通过和细胞膜的CD3ζ链结合，传递信号。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗人NKp30单克隆抗体，具体地说，针对NKp30第19至130位氨基酸中序列有反应性的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G5。

本发明的又一个目的是提供本发明单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在免疫印迹检测NKp30试验中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在免疫沉淀NKp30试验中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在ELISA检测NKp30中的应用。

本发明的又一个目的是提供单克隆抗体在流式细胞术检测NKp30试验中的应用。

为此，本发明人原核表达NKp30胞外段重组蛋白，通过复性与纯化，获得重组NKp30蛋白。用重组NKp30蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用Protein G亲和层析纯化抗体。并且对单克隆抗体进行效价测定、亲和常数的测定、Ig亚类的测定和特异性的鉴定。NKp30单克隆抗体的制备，为NKp30分子的检测以及NKp30功能的研究提供了基础，NKp30单克隆抗体可以广泛用于分子免疫学的研究中。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种抗人NKp30的单克隆抗体，其针对人NKp30的第19至130位氨基酸序列有反应性。人NKp30的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，DNA序列如SEQ ID No.1所示，本文中原核重组表达的NKp30的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据以上1所述的单克隆抗体，其为IgG1κ亚类。

3.根据以上1所述的单克隆抗体，其是可以由保藏号为CGMCC No.4244的杂交瘤细胞株3G5分泌产生的单克隆抗体P30-3G5。

4.小鼠杂交瘤细胞株3G5，其保藏号为CGMCC No.4244。

5.根据以上1-3中任一项所述的单克隆抗体在检测NKp30中的应用，其中所述检测是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术来进行的。

6.用于检测NKp30的试剂盒，其包含以上1-3中任一项所述的单克隆抗体。

7.根据以上6的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK细胞系或PBMC细胞上的NKp30。

8.一种检测细胞上的NKp30的方法，该方法包括：(1)将以上1-3中任一项所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

9.根据以上8的方法，其中所述阳性反应是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术检测进行判断的。

有益效果