[发明专利]艾迪注射制剂的检测方法

权利要求书

1.一种艾迪注射制剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法为：

性状：对于冻干粉针剂，产品为浅黄色至浅棕色的疏松块状物；

对于输液剂，产品为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

对于水针剂，产品为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)分别取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液浓缩、或直接取水针剂，加乙醇搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％α-萘酚乙醇溶液，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸，在二液面接界处显紫红色环；

(2)分别取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液浓缩、或直接取水针剂，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-4次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，用水洗涤，再用20-80％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg₁、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝1-10∶2-15∶1-10∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

PH值：应为3.0-6.5；

重金属：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；置坩埚中，水浴上蒸干，照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；

热原：取冻干粉针300-600mg加注射用水30ml使溶解、或取输液100-300ml浓缩至30ml、或取水针剂30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1Kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；

蛋白质：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；加新配制的30％磺基水杨酸溶液1ml，混匀，放置5分钟，不得出现浑浊；

鞣质：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，必要时，用0.45um微孔滤膜滤过，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀；

树脂：取冻干粉针50-100mg加注射用水5ml使溶解、或取输液20-50ml浓缩至5ml、或取水针剂5ml；加盐酸1滴，放置30分钟，不得出现沉淀；

草酸盐：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；用稀盐酸调节PH值至1-2，滤过，滤液调节PH值至5-6，加3％氯化钙溶液2-3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀；

钾离子：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；蒸干，按照中国药典钾离子测定法测定，应符合规定；

砷盐：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；精密量取，于坩埚中蒸干，加2％的硝酸镁乙醇溶液3ml，点燃，燃尽后，先用小火炽灼使炭化，再在500-600℃炽灼至完全灰化，放冷，加盐酸5ml与水21ml使溶解，照中国药典砷盐检查法检查；每1ml成品中含砷量不得过百万分之二；

溶血与凝聚：2％红细胞混悬液的制备取兔血或羊血数毫升，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加约10倍量的生理氯化钠溶液洗涤2-3次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理氯化钠溶液配成2％的混悬液，即得；

供试品溶液的制备：取冻干粉针100-200mg加注射用水10ml使溶解、或取输液40-100ml浓缩至10ml、或取水针剂10ml；加生理氯化钠溶液稀释成50ml，混匀，即得；

试验方法：取试管6支，按下表中配比量依次加入2％红细胞混悬液和生理氯化钠溶液，混匀后，于37℃恒温箱中放置30分钟，分别加入不同量的供试品溶液，第6管为对照管，摇匀后，置37℃±0.5℃恒温箱中，开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，共观察3小时；

按上法检查，以第3管为准，本品在3小时内不得出现溶血和红细胞凝聚；

异常毒性：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；按小鼠每只0.5ml，照中国药典异常毒性检查法检查；

过敏物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按豚鼠致敏剂量为0.5ml/只，激发剂量为1.0ml/只；照中国药典过敏物质检查法检查，应符合规定；

升压物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按大鼠体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典升压物质检查法检查，应符合规定；

降压物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按猫体重1kg注射1ml的剂量，照中国药典降压物质检查法检查，应符合规定；

其他：应符合中国药典注射剂项下有关的各项规定；

含量测定：

(1)人参皂苷Re

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液、高氯酸，摇匀，置水浴中加热，取出，用水冷却，加冰醋酸，摇匀，照中国药典分光光度法，测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：分别取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液浓缩、或直接取水针剂，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-4次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度；从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，冻干粉针剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于1％；输液剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.01mg/ml；水针剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.1mg/ml；

(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和1-10％，0.5-2∶0.5-2混合装柱；柱温为180±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：分别取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液浓缩、或直接取水针剂，加入1-3mol/L硫酸溶液，用氯仿振摇提取1-5次，合并氯仿液，用K-D浓缩器浓缩定容，即得；

测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算，即得；该注射制剂中，冻干粉针剂中含斑蝥素为0.0005％-0.05％；输液剂中含斑蝥素为0.00001-0.001mg/ml；水针剂中含斑蝥素为0.0001-0.005mg/ml。

2.按照权利要求1所述艾迪注射制剂的检测方法，其特征在于：具体的检测方法为：性状：对于冻干粉针剂，产品为浅黄色至浅棕色的疏松块状物；

对于输液剂，产品为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

对于水针剂，产品为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取冻干粉针400-1000mg加注射用水5-20ml使溶解、或取输液200-500ml浓缩至5-20ml、或取水针剂20-100ml浓缩至5-20ml；分别取上述药品，加乙醇20-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-4次，将沉淀物用蒸馏水2-10ml溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％α-萘酚乙醇溶液2-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.2-2m1，在二液面接界处显紫红色环；

(2)取冻干粉针400-1000mg加注射用水20-100ml使溶解、或取输液200-500ml浓缩至20-100ml、或取水针剂20-100ml；置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-4次，每次10-60ml，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水1-10ml溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，内径0.5～2cm，长10-20cm，填充10-15cm的DA-201树脂后，再填充1-5g中性氧化铝；用水50-200ml洗涤，再用20-80％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg₁、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-3mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3-20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝1-10∶2-15∶1-10∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯200-500nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

PH值：应为3.0-6.5；

重金属：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；置坩埚中，水浴上蒸干，照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；

热原：取冻干粉针300-600mg加注射用水30ml使溶解、或取输液100-300ml浓缩至30ml、或取水针剂30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1Kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；

蛋白质：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；加新配制的30％磺基水杨酸溶液1ml，混匀，放置5分钟，不得出现浑浊；

鞣质：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，必要时，用0.45um微孔滤膜滤过，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀；

树脂：取冻干粉针50-100mg加注射用水5ml使溶解、或取输液20-50ml浓缩至5ml、或取水针剂5ml；加盐酸1滴，放置30分钟，不得出现沉淀；

草酸盐：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；用稀盐酸调节PH值至1-2，滤过，滤液调节PH值至5-6，加3％氯化钙溶液2-3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀；

钾离子：取冻干粉针20-40mg加注射用水2ml使溶解、或取输液8-20ml浓缩至2ml、或取水针剂2ml；蒸干，按照中国药典钾离子测定法测定，应符合规定；

砷盐：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；精密量取，于坩埚中蒸干，加2％的硝酸镁乙醇溶液3ml，点燃，燃尽后，先用小火炽灼使炭化，再在500-600℃炽灼至完全灰化，放冷，加盐酸5ml与水21ml使溶解，照中国药典砷盐检查法检查；每1ml成品中含砷量不得过百万分之二；

溶血与凝聚：2％红细胞混悬液的制备取兔血或羊血数毫升，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加约10倍量的生理氯化钠溶液洗涤2-3次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理氯化钠溶液配成2％的混悬液，即得；

供试品溶液的制备：取冻干粉针100-200mg加注射用水10ml使溶解、或取输液40-100ml浓缩至10ml、或取水针剂10ml；加生理氯化钠溶液稀释成50ml，混匀，即得；

试验方法：取试管6支，按下表中配比量依次加入2％红细胞混悬液和生理氯化钠溶液，混匀后，于37℃恒温箱中放置30分钟，分别加入不同量的供试品溶液，第6管为对照管，摇匀后，置37℃±0.5℃恒温箱中，开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，共观察3小时；

按上法检查，以第3管为准，本品在3小时内不得出现溶血和红细胞凝聚；

异常毒性：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；按小鼠每只0.5ml，照中国药典异常毒性检查法检查；

过敏物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按豚鼠致敏剂量为0.5ml/只，激发剂量为1.0ml/只；照中国药典过敏物质检查法检查，应符合规定；

升压物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按大鼠体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典升压物质检查法检查，应符合规定；

降压物质检查：取冻干粉针加注射用水使溶解、或取输液、或取水针剂；以原药浓度，按猫体重1kg注射1ml的剂量，照中国药典降压物质检查法检查，应符合规定；

其他：应符合中国药典注射剂项下有关的各项规定；

含量测定：

(1)人参皂苷Re

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，置量瓶中，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re 1-2mg，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液0.05-1ml、高氯酸0.5-1.5ml，摇匀，置40-80℃水浴中加热8-25分钟，取出，用水冷却1-3分钟，加冰醋酸2-10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在400-700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取冻干粉针200-400mg加注射用水10-30ml使溶解、或取输液50-200ml浓缩至10-30ml、或取水针剂10-30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，每次10-30ml，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-4次，每次2-10ml，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，每次40-60ml，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1-5g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，控制流速为0.3-0.6ml/min，弃去洗液，用40-90％乙醇70-100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度；从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，冻干粉针剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于1％；输液剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.01mg/ml；水针剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.1mg/ml；

(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和1-10％，0.5-2∶0.5-2混合装柱；柱温为180±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05-0.2mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取冻干粉针400-1000mg加注射用水20-100ml使溶解、或取输液200-500ml浓缩至20-100ml、或取水针剂20-100ml，加入1-3mol/L硫酸溶液2-10ml，用氯仿振摇提取1-5次，每次10-100ml，合并氯仿液，用K-D浓缩器浓缩定容至2-8ml，即得；测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算，即得；该注射制剂中，冻干粉针剂中含斑蝥素为0.0005％-0.05％；输液剂中含斑蝥素为0.00001-0.001mg/ml；水针剂中含斑蝥素为0.0001-0.005mg/ml。