[发明专利]一种胆红素氧化酶固体发酵方法

说明书

技术领域：

    本发明涉及胆红素氧化酶的发酵，特别是一种胆红素氧化酶固体发酵方法。

背景技术：

    胆红素氧化酶（Bilirubin oxidase，EC 1．3．3．5）是一种含铜的多酚氧化酶，能催化胆红素氧化，氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧化最终生成性质还不清楚的无色化合物。利用此反应，测定波长在440nm或450nm处吸光值的下降，可以用于血清胆红素的测定。自从1981年日本学者发现漆斑菌属能高产胆红素氧化酶后，临床医学中开始使用该酶来测定胆红素，该方法具有特异性、灵敏高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测。胆红素氧化酶在临床中可用于诊断黄疸水平，并有望用于新生儿黄疸及高胆红素血症的治疗。近年来，胆红素氧化酶的应用逐渐拓宽，被用于生物电池的制造、污水处理等方面的研究和应用。由于胆红素氧化酶具有广泛的用途，对于该酶的需求量也越来越大。但因为胆红素氧化酶生产发酵工艺复杂，成本高，造成市场上销售的胆红素氧化酶价格昂贵，严重阻碍了胆红素氧化酶的应用，所以对胆红素氧化酶发酵方法的研究以及如何提高产量成为酶生成产中迫切需要解决的问题。

但现行的胆红素氧化酶生产多是采用液体深层发酵通气搅拌的方式获得，所用培养基以PDB为主，其主要生产菌株是漆斑菌属。液体深层通气发酵需要对培养基进行高温高压蒸汽消毒，之后对培养基进行降温后接入菌种，然后进行通气搅拌发酵。该方法蒸汽消耗量大，搅拌和通气培养时间长，能耗高，并且发酵后污水排放量大。到目前为止，还未见到关于胆红素氧化酶的固体发酵方法的报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成本低，生产过程简单，酶提取方便的胆红素氧化酶固体发酵方法。本发明的技术方案是，一种胆红素氧化酶固体发酵方法，其特征在于：（1）从土壤中分离筛选出露湿漆斑菌，并制出露湿漆斑菌孢子悬浮液；（2）称取3-7重量份的麸皮置于三角瓶中，然后加入13-17重量份的蒸馏水，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，121~130℃高压灭菌20~30分钟，冷却后，接入用步骤（1）培养出的1~5重量份的孢子悬浮液，在培养温度为22℃~31℃，培养时间为7~11天后，取出培养后的三角瓶，在三角瓶中加入50-70重量份的蒸馏水，用摇床振荡浸提2-4小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液。所述步骤（1）中的露湿漆斑菌孢子悬浮液为将其接种在PDA斜面培养基上，培养10天左右，加上一定量的无菌水，制成孢子量为1×10⁸~10×10⁸个/ml的露湿漆斑菌孢子悬浮液。所述步骤（2）当中的13-17重量份的蒸馏水可以被12~18份浓度为0.1~5毫摩尔/升铜离子。溶液取代。固体培养基的麸皮，为经过40目筛所得。

本发明所用原料来源丰富、易取，生产成本低，酶提取的工艺简便易行，生产过程节能环保。

具体实施方式：

具体描述实施例：

实施例1：麸皮从市场购买后过40目筛。称取3g麸皮置于250ml三角瓶中，然后加入蒸馏水13ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，121℃高压灭菌20分钟，冷却后，接入1ml浓度为1×10⁸~10×10⁸个/ml的孢子悬浮液，22℃静置培养11天。取出培养11天后的三角瓶，在三角瓶中加入50ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提2.5小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液，其酶活力可达25.4U/克。

实施例2：麸皮从市场购买后过40目筛。称取7g麸皮置于250ml三角瓶中，然后加入蒸馏水17ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，125℃高压灭菌25分钟，冷却后，接入5ml浓度为1×10⁸~10×10⁸个/ml的孢子悬浮液，31℃静置培养7天。取出培养7天后的三角瓶，在三角瓶中加入65ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提3.5小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液，其酶活力可达26.2U/克。

实施例3：麸皮从市场购买后过40目筛。称取5g麸皮置于250ml三角瓶中，然后加入蒸馏水15ml，用玻棒将麸皮和蒸馏水搅拌均匀，130℃高压灭菌30分钟，冷却后，接入1.5ml浓度为1×10⁸~10×10⁸个/ml的孢子悬浮液，26℃静置培养9天。取出培养9天后的三角瓶，在三角瓶中加入60ml的蒸馏水，180r/min振荡浸提3.5小时，用定性滤纸过滤即得胆红素氧化酶粗酶液，其酶活力可达27.6U/克。