[发明专利]玉米褪绿斑驳病毒检测用引物及探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及玉米褪绿斑驳病毒检测用引物及探针。

背景技术

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus，MCMV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，是危害玉米的重要病毒，另外还可侵染小麦、大麦、燕麦、高粱和一些杂草。寄主被侵染后，症状表现为坏死斑驳、卷曲、叶尖坏死、矮化、植株死亡等。自然侵染作物导致损失10％～15％，试验玉米损失达59％；与玉米褪绿矮缩病毒(Maizechlorotic dwarf virus，MCDV)或小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus，WSMV)共同侵染损失高达91％。该病毒已列入我国进境植物检疫性有害生物名录之中。国内学者对该病毒研究不是很多，因而相关资料及防治经验很少。

目前该病毒分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国(堪萨斯州、内布拉斯加州、夏威夷)及泰国。MCMV可经玉米种子、介体甲虫、蓟马等传毒，一旦田间有植株发病，病毒将快速扩散，往往在短时间内就会导致玉米大面积发病，导致严重的经济损失。根据风险分析的介体适生区，一旦该病毒病发生，导致我国的玉米经济损失将高达140亿元人民币。2009年，山东出入境检验检疫局首次在美国进境大豆混杂的玉米种子中截获该病毒，说明该病毒传入的风险很高。

本发明选择玉米褪绿斑驳病毒P32蛋白基因保守区序列，设计用于实时荧光RT-PCR检测的引物及探针，通过对反应的退火温度的优化建立了玉米褪绿斑驳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，反应结束后即可根据扩增曲线判定样品中是否含有玉米褪绿斑驳病毒。

发明内容

本发明目的在于提供用于玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物及探针序列。

本发明通过分析已报道的玉米褪绿斑驳病毒p32蛋白基因的保守区序列，设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表MCMVf& MCMVr所示；所述探针的核苷酸序列如序列表MCMVp所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。可用的报告荧光染料有FAM/hex/tet/joe/vic/fitc/cy3/cy5，可用的淬灭荧光染料有TAMRA/rox/dabcy1/bhq1/bhq2。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5′端，淬灭荧光染料标记在探针的3′端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5′端到3′端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对玉米褪绿斑驳病毒的检测。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的实时荧光RT-PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在50μL反应体系中加入20.25μL DEPC处理水，25μL 2×无UNG酶的主混合液(Master Mix without UNG)，1.25μL40×反转录酶及RNA酶抑制剂混合液(MultiScribe and RNase Inhibitor Mix)，1μL引物MCMVf(20μmol/L)，1μL引物MCMVr(20μmol/L)，0.5μL探针MCMVp(20μmol/L)，2ng总RNA。一步法反转录荧光PCR主混合液(PCR TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents)购自Applied Biosystems公司。

其中，上述反应条件可以是：42℃，5min；95℃，10s；95℃，5s，60℃，20s，共40个循环。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用于不同方法的实时荧光RT-PCR检测。

进一步，还可以将本发明引物、探针及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。