[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的RP-HPLC检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白分析领域，具体地说，涉及一种精确测定重组人粒细胞集落刺激因子化学稳定性的RP-HPLC方法。

背景技术

DNA重组技术的出现使得大量的重组蛋白质成功应用于治疗各种疾病，其中细胞因子类就包括促红细胞生成素(EPO)、干扰素(IFN-α，IFN-β、IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白细胞介素(IL)等。与小分子化学药相比，重组药物蛋白质在较低浓度下就具有较高的活性和特异性。但是由于重组蛋白质本身的物理及化学不稳定性，一般都采用注射给药的方式。为了确保一定的有效期，药用蛋白质一般需要冷藏或者冷冻干燥以固体形式存放。

蛋白质长期保藏中的不稳定性的主要原因是脱酰胺作用[Robinson NE.Protein deamidation[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2002，99(8)：5283-5288.]、氧化作用[Stadtman，E R，Levine，R L Protein Oxidation[J].Ann.N.Y.Acad.Sci.，2000，899：191-208]和蛋白质聚集[Wang W.Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics[J].Int J Pharm.2005，289：1-30]。蛋白质氨基酸组成中的天冬酰胺和谷氨酰胺都会发生脱酰胺作用，而且天冬酰胺比谷氨酰胺更容易发生脱酰胺作用。由于rhG-CSF不含天冬酰胺(Asn)但含有17个谷氨酰胺，因此脱酰胺作用发生在谷氨酰胺上，但是由于其制剂长期保存于pH4.0的微酸环境，脱酰胺作用相对不明显。据Stadtman，E R报道，蛋白质组成中的组氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸残基容易被氧化，尤其是甲硫氨酸和半胱氨酸更容易被氧化。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)只有一个游离的半胱氨酸(Cys¹⁷)，含有4个甲硫氨酸残基，因此氧化主要发生在是Met上，四个甲硫氨酸被氧化的容易程度为：Met¹＞Met¹³⁸＞Met¹²⁷＞Met¹²²[Reubsaet J L，Beijnen J H，Bult A.Oxidation of recombinant methionyl human granulocyte colony stimulating factor[J].J Pharm Biomed Anal.，1998，17(2)：283-289]。各种环境条件，如曝光、储藏温度和活性氧对氧化作用影响较大，而且制剂中吐温80等辅料中含有的微量过氧化氢也是甲硫氨酸氧化的原因之一。在重组蛋白制剂生产过程中可能混入少量的过渡态金属离子也有可能导致蛋白质中氨基酸的氧化。因此，有必要采用准确灵敏的分析方法来测定重组蛋白如重组人粒细胞集落刺激因子及其注射液中在各种环境下稳定性情况。

基于C4柱和C18柱的反相色谱法常用于检测重组人粒细胞集落刺激因子及其注射液中有效成分纯度。已知重组人粒细胞集落刺激因子在稳定性试验中主要是甲硫氨酸残基等发生氧化，已经知道有Met¹，Met¹³⁸，Met¹²⁷，Met¹²²都容易被氧化，因此有多种氧化形式产生，但彼此间疏水性差异很小，由于C4柱的疏水性比C18柱弱，C4柱可能更适合用于rhG-CSF产品纯度测定。《欧洲药典》6.3版[European Pharmacopoeia 6.3.Filgrastim concentrated solution[S].01/2009：2206，EDQM]首先采用的C18柱，现行6.8版[European Pharmacopoeia 6.8.Filgrastim concentrated solution[S].07/2010：2206，EDQM]，反映出C4柱检测具有更高的灵敏度。但是《中国药典》2010版还是采用C18柱的方法。