[发明专利]一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒。

背景技术：

质粒DNA是分子生物学研究几乎每天都要用到质粒DNA，也需要经常纯化质粒DNA，此外在基因治疗和基因疫苗领域，随着越来越多的基因治疗药物和基因疫苗进入临床试验和产业化阶段，对质粒DNA的需求量也越来越大。由于临床用质粒DNA的质量标准跟分子生物学研究用质粒DNA的要求不同，小规模实验室纯化与工业级大规模纯化工艺也有所差异，因此一个好的质粒DNA纯化技术必须满足各个领域的不同需求。目前能达到此要求的只有基于碱裂解质粒DNA纯化方法，另一个方法煮沸法的使用主要集中在于分子生物学研究领域。

一、碱裂解法质粒DNA(共价闭合环状DNA)纯化技术

碱裂解法是1979年由Birnboim & Doly发明，它的质粒粗提部分由四步操作组成：第一步，细菌重悬。重悬液成份是25mM Tris-Cl(pH 8.0)、50mM葡萄糖和10mM EDTA。其中Tris-Cl用于缓冲pH以稳定DNA结构；葡萄糖用于保持渗透压和缓冲pH，防止基因组DNA过度断裂；EDTA用于鰲合二价金属离子，使细胞更易破碎，也使DNase失活，有利于保持质粒DNA的完整性。第二步，碱裂解。碱裂解液的成分是1％SDS和0.2M NaOH。SDS和NaOH的第一个作用是使细胞裂解释放菌体内容物。NaOH的第二个作用是使体系的pH保持在12.0-12.5之间，在此pH范围内，基因组DNA不可逆变性而质粒DNA由于有特有的拓扑超螺旋结构，只发生可逆变性，可以在下一步中和过程中自然复性；SDS的第二个作用是溶解蛋白质(平均两个氨基酸上结合一个SDS分子)和脂肪。第三步，中和。中和液的成份是3M醋酸钾/2M醋酸。它一方面中和NaOH，使质粒DNA复性而基因组DNA仍然保持单链状态；另一方面提高体系中的盐浓度，使蛋白质、基因组DNA和RNA发生盐析沉淀；此外加入的钾与SDS反应生成不溶的十二烷基硫酸钾(PDS)，PDS还与蛋白质和基因组DNA共沉淀。所以中和反应后，大部分蛋白质、基因组DNA和RNA都以不溶物状态存在，而大部分的质粒DNA由于分子量较小，不形成任何沉淀，而是以溶液状态存在。第四步，离心。离心过程使第三步形成的所有不溶物沉淀到管底，上清为质粒DNA粗提液，可以直接用于各种质粒精提方法进行进一步的纯化处理。

碱裂解法的最大优点是技术成熟，可以处理从1mL到500mL或更多的样品，既适合于小规模的科研使用，又能用于工业级大规模生产临床用的质粒DNA，并且适用于大肠杆菌的所有菌株。

其主要缺点是操作难以控制，主要原因是使基因组DNA发生不可逆变性而环状质粒DNA发生可逆变性的pH范围十分狭小，在12-12.5之间。如果pH低于12.0则基因组DNA将不能充分变性，就会污染质粒DNA；如果pH高于12.5，则质粒DNA发生不可逆变性，降低质粒DNA产量。为了将pH维持在此范围，加入碱裂解液后必须迅速充分混匀，但是在碱裂解释放出细菌的基因组DNA后，裂解液变得十分粘稠，只有剧烈搅拌才能充分混匀，而剧烈搅拌又会使质粒DNA断裂成为线性DNA，跟基因组DNA一样发生不可逆变性而丢失，降低产量；剧烈搅拌还会使大的基因组DNA断裂成小片段，难以形成沉淀，最后污染质粒DNA。所以碱裂解法纯化质粒DNA的操作十分难以优化，对工业级大规模(10升以上)处理更是如此。

碱裂解法的另一缺点是大规模处理时不容易去除RNA污染。研究用小规模质粒DNA纯化时可以使用动物源性的RNase，但是在工业级大规模(10升以上规模)纯化临床用质粒DNA时，大规模使用动物源性的RNase不现实，因为不但价格十分昂贵，而且还容易引入动物的病毒和其他病原(如疯牛病病毒)，增加很多的质量检测方面的麻烦，使成本急剧上升。目前一般采取非酶的办法去除RNA，但还是需要增加了很多操作步骤，增加了成本。

碱裂解法的第三个缺点是步骤多，质粒DNA损失多，最终回收率只有50-70％左右。

二、煮沸法质粒DNA纯化技术